Compuestos para la inhibición enzimática del proteosoma.

Un compuesto que tiene una estructura de fórmula (III) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

**Fórmula**

en la que:

cada Ar es, de manera independiente, un grupo aromático o heteroaromático opcionalmente sustituido con 1 a 4 sustituyentes;

L se selecciona entre C≥O, C≥S y SO2;

X es O;

Y está ausente o se selecciona entre C≥O y SO2;

R1, R2 y R3 se seleccionan, cada uno de manera independiente, entre alquilo C1-6, hidroxialquilo C1-6, alcoxialquilo C1-6, arilo y aralquilo C1-6, estando cada uno de los cuales opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes amida, amina, ácido carboxílico (o una sal del mismo), éster, tiol o tioéter;

R4 es N(R5)L-R6;

R5 es hidrógeno,

R6 se selecciona entre Ar-Y-, carbociclilo y heterociclilo; y

R7 y R8 son hidrógeno;

en donde "alquilo" consiste en grupos alquilo o haloalquilo no sustituidos.

Compuestos para la inhibición enzimática del proteosoma Campo técnico

La presente invención se refiere a compuestos y a métodos de inhibición enzimática. En particular, la invención se refiere a métodos terapéuticos basados en la inhibición enzimática.

Antecedentes de la invención

En eucariotas, la degradación de las proteínas está mediada predominantemente por la ruta de la ubiquitina, en la que las proteínas objeto de la destrucción están ligadas al polipéptido ubiquitina de 76 aminoácidos. Una vez atacadas, las proteínas ubiquitinadas sirven después como sustratos para el proteosoma 26S, una proteasa multicatalítica, que escinde las proteínas en péptidos cortos mediante la acción de sus tres actividades proteolíticas principales. Aunque tiene una función general en el recambio de las proteínas intracelulares, la degradación mediada por el proteosoma también desempeña un papel clave en muchos procesos tales como la presentación del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I, la apoptosis, la división celular y activación de NF-kB.

El proteosoma 20S es un complejo proteasa multicatalítico de forma cilindrica de 700 kDa compuesto de 28 subunidades organizadas en cuatro anillos que desempeña importantes papeles en la regulación del crecimiento celular, la presentación del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I, la apoptosis, el procesamiento de antígenos, la activación de NF-kB y la transducción de las señales proinflamatorias. En levaduras y otros eucariotas, 7 subunidades a diferentes forman los anillos exteriores y 7 subunidades p diferentes comprenden los anillos interiores. Las subunidades a sirven como sitios de unión para los complejos reguladores 19S (PA700) y 11S (PA28), así como sirven como una barrera física para la cámara proteolítica interior formada por los dos anillos de subunidades p. Así pues, in vivo, se cree que el proteosoma existe como una partícula 26S ("el proteosoma 26S"). Los experimentos in vivo han demostrado que la inhibición de la forma 20S del proteosoma se puede correlacionar muy fácilmente con la inhibición del proteosoma 26S. La escisión de las prosecuencias aminoterminales de las subunidades p durante la formación de las partículas expone los restos de treonina aminoterminales, que sirven como nucleófilos catalíticos. Las subunidades responsables de la actividad catalítica en el proteosoma poseen, por tanto, un resto nucleófilo aminoterminal, y estas subunidades pertenecen a la familia de las hidrolasas nucleófilas N-terminales (Ntn) (donde el resto nucleófilo N-terminal es, por ejemplo, Cys, Ser, Thr y otros restos nucleófilos). Esta familia incluye, por ejemplo, penicilina G acilasa (PGA), penicilina V acilasa (PVA), glutamina PRP amidotransferasa y glicosilasparraginasa bacteriana. Además de las subunidades p expresadas ubicuamente, los vertebrados superiores también poseen tres subunidades p inducibles por el interferón y (LMP7, LMP2 y MECLI), que reemplazan a sus homólogos normales, X, Y y Z respectivamente, modificando así las actividades catalíticas del proteosoma. Mediante el uso de diferentes sustratos peptídicos, se han definido tres actividades proteolíticas principales para el proteosoma 20S eucariota: la actividad de tipo quimiotripsina (CT-L), que escinde detrás de los grandes restos hidrófobos; la actividad de tipo tripsina (T-L), que escinde detrás de los restos básicos; y la actividad que hidroliza el péptido peptidilglutamilo (PGPH), que escinde detrás de los restos ácidos. También se han atribuido al proteosoma dos actividades menos caracterizadas adicionales: la actividad BrAAP, que escinde detrás de aminoácidos de cadena ramificada; y la actividad SNAAP, que escinde detrás de aminoácidos neutros pequeños. Las principales actividades proteolíticas del proteosoma parecen estar asistidas por diferentes sitios catalíticos, dado que los inhibidores, las mutaciones puntuales en las subunidades (5 y el intercambio de subunidades p que inducen el interferón y alteran estas actividades en diversos grados.

Hay varios ejemplos de moléculas pequeñas que se han usado para inhibir la actividad del proteosoma; sin embargo, en general, estos compuestos carecen de la especificidad, la estabilidad o la potencia necesarias para explorar y aprovechar los papeles del proteosoma a nivel celular y molecular. Por lo tanto, se requiere la síntesis de inhibidor(es) de molécula pequeña con mayor especificidad de sitio, mejor estabilidad y solubilidad, y mayor potencia para permitir la exploración de los papeles del proteosoma al nivel celular y molecular.

En Chem. Biol. Vol. 6, 1999, 811-822; Mol. Cell., Vol. 7, 2001,45 411-420; Tetrahedron letters, vol. 41, 2000, 6005- 6009; Medicinal Research Reviews, Vol. 21, 2001, 245-273 y el documento WO-A-0128579, se desvelan epoxicetonas inhibidoras del proteosoma.

Sumario de la invención

La invención se refiere a clases de moléculas conocidas como péptidos a,P-epóxidos. Se entiende que las moléculas precursoras se unen eficaz, irreversible y selectivamente a la hidrolasa nucleófila N-terminal (Ntn), y pueden inhibir específicamente determinadas actividades de enzimas que tienen actividad catalítica múltiple.

Antes se pensaba que simplemente disponía de proteínas desnaturalizadas y mal plegadas, pero hoy en día se admite que el proteosoma constituye una maquinaria proteolítica que regula los niveles de diversas proteínas

intracelulares a través de su degradación de una manera dependiente de la señal. Por consiguiente, hay un gran interés en identificar los reactivos que pueden perturbar específicamente las actividades del proteosoma y otras hidrolasas Ntn y, por lo tanto, que se puedan usar como sondas para estudiar el papel de estas enzimas en los procesos biológicos. En el presente documento, se describen, sintetizan e investigan compuestos dirigidos a las hidrolasas Ntn. Se desvelan y reivindican epóxidos peptídicos que pueden inhibir determinadas actividades del proteosoma de manera potente, selectiva e irreversible.

A diferencia de otros varios inhibidores basados en péptidos, no se espera que los epóxidos peptídicos descritos en el presente documento inhiban sustancialmente las proteasas no proteosómicas tales como la tripsina, la quimiotripsina, la catepsina B, la papaína y la calpaína a concentraciones de hasta 50 pM. A concentraciones superiores, se puede observar la inhibición, pero cabría esperar que fuera competitiva y no irreversible si el inhibidor simplemente compite con el sustrato. También se espera que los epóxidos peptídicos y las aziridinas peptídicas novedosos inhiban la activación de NF-kB y estabilicen los niveles de p53 en cultivo celular. Además, cabría esperar que estos compuestos tuvieran actividad antiinflamatoria. Así pues, estos compuestos pueden ser sondas moleculares únicas, que tienen la versatilidad de explorar la función de enzimas Ntn en procesos biológicos y patológicos normales.

En un aspecto, la invención proporciona inhibidores que comprenden un anillo de tres miembros que contiene heteroátomos como se define en las reivindicaciones anexas. Estos inhibidores pueden inhibir la actividad catalítica de las enzimas hidrolasas nucleófilas N-terminales (por ejemplo, el proteosoma 20S o el proteosoma 26S) cuando dicho inhibidor está presente a concentraciones inferiores a aproximadamente 50 pM. Con respecto al proteosoma 20S, determinados inhibidores de hidrolasa inhiben la actividad de tipo quimiotripsina del proteosoma 20S cuando el inhibidor está presente a concentraciones inferiores a aproximadamente 5 pM, y no inhiben la actividad de tipo tripsina ni la actividad PGPH del proteosoma 20S cuando el inhibidor está presente a concentraciones inferiores a aproximadamente 5 pM.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad farmacéuticamente eficaz del inhibidor de hidrolasa, que mejoran los efectos de la enfermedad neurodegenerativa (tal como la enfermedad de Alzheimer), las enfermedades de atrofia muscular, el cáncer, las enfermedades infecciosas crónicas, la fiebre, la inactividad muscular, la denervación, la lesión nerviosa, el ayuno y las afecciones relacionadas con el sistema inmune, entre otras.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones antiinflamatorias.

En otro aspecto, la invención proporciona compuestos para su uso en lo siguiente: inhibir o reducir la infección por VIH en un sujeto; afectar al nivel de expresión génica viral en un sujeto; alterar la variedad de péptidos antigénicos producidos por el proteosoma en un organismo; determinar si un proceso celular, del desarrollo, o fisiológico o de producción... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto que tiene una estructura de fórmula (III) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:

en la que:

cada Ar es, de manera independiente, un grupo aromático o heteroaromático opcionalmente sustituido con 1 a 4 sustituyentes;

L se selecciona entre C=0, C=S y SO2;

X es O;

Y está ausente o se selecciona entre C=0 y SO2;

R1, R2 y R3 se seleccionan, cada uno de manera independiente, entre alquilo C1-6, hidroxialquilo C1-6, alcoxialquilo C1-6, arilo y aralquilo C1-6, estando cada uno de los cuales opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes amida, amina, ácido carboxílico (o una sal del mismo), áster, tiol o tioéter;

R4 es N(R5)L-R6;

R5 es hidrógeno,

R6 se selecciona entre Ar-Y-, carbociclilo y heterociclilo; y R7 y R8 son hidrógeno;

en donde "alquilo" consiste en grupos alquilo o haloalqullo no sustituidos.

2. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R1, R2 y R3 se seleccionan, de manera independiente, entre alcoxialquilo C1.6, alquilo Ci-6, arilo y aralquilo C1.6.

3. Un compuesto de la reivindicación 2, en el que R1 y R2 son alcoxialquilo C1.6O alquilo Ci-6; y R3 es alquilo Ci-6o aralquilo C1.6.

4. Un compuesto de la reivindicación 2, en el que R1 y R3 son ambos isobutilo y R2 es fenilmetilo.

5. Un compuesto de la reivindicación 3, en el que L es C=0 o SO2 y R6 es Ar-Y o heterociclilo.

6. Un compuesto de la reivindicación 5, en el que cada Ar se selecciona, de manera independiente, entre fenilo, indolilo, benzofuranilo, naftilo, quinolinilo, quinolonilo, tienilo, piridilo, pirazilo, pirrolilo, furanilo, tiofenilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, triazolilo, pirazolilo, piridazilo y pirimidilo, o en el que heterociclilo se selecciona entre cromonilo, cromanilo, morfolino y piperidinilo.

7. Un compuesto de la reivindicación 6, en el que Ar está sustituido con Ar-Q-, en donde Q se selecciona entre un enlace directo, -O- y alquilo C1.6.

8. Un compuesto de la reivindicación 4, en el que L es C=0 o SO2 y R6 se selecciona entre Ar-Y y heterociclilo.

9. Un compuesto de la reivindicación 8, en el que R6 se selecciona entre cromonilo, cromanilo, morfolino y piperidinilo.

10. Un compuesto de la reivindicación 8, en el que R6 es Ar-Y y Ar se selecciona entre fenilo, indolilo, benzofuranilo, naftilo, quinolinilo, quinolonilo, tienilo, piridilo y pirazilo.

11. Un compuesto de la reivindicación 4, en el que L es C=0 o SO2.

12. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en la inhibición de una hidrolasa nucleófila N-terminal, en el que dicho inhibidor inhibe una actividad de tipo quimiotripsina de dicho proteosoma 20S cuando dicho inhibidor está presente a concentraciones inferiores a aproximadamente 5 pM y no inhibe la actividad

de tipo tripsina ni la actividad de PGPH de dicho proteosoma 20S cuando dicho inhibidor está presente a concentraciones inferiores a aproximadamente 5 pM.

14. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento de la inflamación.

15. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en la inhibición o la reducción de la infección por VIH.

16. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa.

17. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento de las enfermedades de atrofia muscular.

18. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento del cáncer.

19. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento de las enfermedades infecciosas crónicas.

20. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento de una afección hiperproliferativa.

21. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento de la inactividad muscular.

22. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento de afecciones relacionadas con el sistema inmune.

23. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en la alteración del nivel de expresión génica viral en un sujeto.

24. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en la alteración de la variedad de péptidos antigénicos producidos por el proteosoma en un organismo.