Composiciones y procedimientos para formulaciones de oligonucleótidos.

Una composición que comprende una mezcla sustancialmente homogénea de oligonucleótidos formadores de dúplex,

en la que la mezcla de oligonucleótidos formadores de dúplex se formula en un tampón de baja salinidad e incluye un soluto, en donde al menos el 50 % de los oligonucleótidos formadores de dúplex están presentes en forma monomérica o dimérica y en donde los oligonucleótidos formadores de dúplex son oligonucleótidos inmunoestimulantes que comprenden:

un dominio de activación de TLR en 5' y al menos dos regiones palindrómicas, siendo una región palindrómica una región palindrómica en 5' de al menos 6 nucleótidos de longitud y conectada a una región palindrómica en 3' de al menos 8 nucleótidos de longitud tanto directamente como mediante un espaciador, que es un ácido nucleico que tiene una longitud de 1-50 nucleótidos o un espaciador de no nucleótido, en donde el oligonucleótido incluye al menos un dinucleótido YpR, y en donde el oligonucleótido no es T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G (SEC ID Nº: 335).

Composiciones y procedimientos para formulaciones de oligonucleótidos

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a composiciones de ácidos nucleicos inmunoestimulantes y a procedimientos de preparación de las mismas.

Antecedentes de la invención

El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, produciendo una de cada cuatro muertes. En 1997, el número total estimado de nuevos diagnósticos de cáncer de pulmón, mama, próstata, colorrectal y de ovario era de aproximadamente dos millones. Debido a la población cada vez más envejecida en los Estados Unidos, es razonable esperar que continúen aumentando las tasas de incidencia del cáncer.

El asma es una enfermedad inflamatoria crónica que afecta a 14-15 millones personas solo en los Estados Unidos.

La enfermedad infecciosa es una de las principales causas de muerte en el mundo. Solo en los Estados Unidos, la tasa de muerte debida a enfermedad infecciosa aumentó al 58 % entre 1980 y 1992. Durante este tiempo, el uso de terapias anti-infecciosas para combatir la enfermedad infecciosa ha crecido significativamente y ahora es una industria de múltiples miles de millones de dólares al año. Incluso con estos aumentos en el uso de agentes antiinfecciosos, el tratamiento y la prevención de la enfermedad infecciosa sigue siendo un reto para la comunidad médica en el mundo.

El ADN bacteriano tiene efectos inmunoestimulantes para activar los linfocitos B y los linfocitos citolíticos espontáneos, pero no el ADN de vertebrado (Tokunaga, T., y col., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79:682-686; Tokunaga, T. y col., 1984, JNCI 72:955-962; Messina, J.P., y col., 1991, J. Immunol. 147:1759-1764; y revisado en Krieg, 1998, en: Applied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein y A.M. Krieg, (Eds.) , John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pág. 431-448) . Ahora se ha entendido que estos efectos inmunoestimulantes del ADN bacteriano son un resultado de la presencia de dinucleótidos CpG no metilados en contextos de bases particulares (motivos CpG) , que son comunes en ADN bacteriano, pero están metilados e infrarepresentados en ADN de vertebrado (Krieg y col., 1995 Nature 374:546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321:1-10) . Los efectos inmunoestimulantes del ADN bacteriano puede ser imitados con oligodesoxinucleótidos (ODN) sintéticos que contienen estos motivos CpG. Tales ODN CpG tienen efectos altamente estimulantes sobre los leucocitos humanos y murinos, induciendo proliferación de linfocitos B; secreción de citocinas e inmunoglobulinas; actividad lítica de linfocitos citolíticos espontáneos (NK) y secreción de IFN-γ; y activación de células dendríticas (DC) y otras células presentadoras de antígeno para expresar moléculas co-estimulantes y secretar citocinas, especialmente las citocinas similares a Th1 que son importantes en promover el desarrollo de las respuestas de linfocitos T similares a Th1. Estos efectos inmunoestimulantes de ODN CpG de esqueleto de fosfodiéster nativo son altamente específicos de CpG porque los efectos se reducen espectacularmente si el motivo CpG está metilado, se cambia a un GpC, o se elimina o altera de otro modo (Krieg y col., 1995 Nature 374:546-549; Hartmann y col., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10) .

En estudios previos, se creyó que el motivo CpG inmunoestimulante siguió la fórmula purina-purina-CpG-pirimidina

pirimidina (Krieg y col., 1995 Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156:421-423; Hacker y col., 1998 EMBO J. 17:6230-6240; Lipford y col., 1998 Trends in Microbiol. 6:496-500) . Sin embargo, ahora está claro que los linfocitos de ratón respondieron bastante bien a motivos CpG de fosfodiéster que no siguen esta "fórmula" (Yi y col., 1998 J. Immunol. 160:5898-5906) y lo mismo es cierto de linfocitos B humanos y células dendríticas (Hartmann y col., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129) .

Recientemente se han descrito varias clases diferentes de oligonucleótidos CpG. Una clase es potente para activar linfocitos B, pero es relativamente débil en inducir IFN-α y la activación de células NK; esta clase se ha llamado la clase B. Los oligonucleótidos CpG de clase B normalmente están completamente estabilizados e incluyen un dinucleótido CpG no metilado dentro de ciertos contextos de bases preferidos. Véanse, por ejemplo, las patentes de 55 EE.UU. nº 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; y 6.339.068. Otra clase de oligonucleótidos CpG activan linfocitos B y células NK e inducen IFN-α; esta clase se ha llamado la clase C. Los oligonucleótidos CpG de clase C, como primero se caracterizaron, normalmente están completamente estabilizados; incluyen una secuencia tipo de clase B y un palíndromo rico en GC o casi palíndromo. Esta clase se ha descrito en la solicitud de patente provisional de EE.UU. en tramitación junto con la presente 60/313.273, presentada el 17 de agosto de 2001, y el documento US 10/224.523, presentado el 19 de agosto de 2002, y la solicitud de patente PCT PCT/US02/26468 relacionada publicada bajo el número de publicación internacional WO 03/015711.

El documento US 2005/0215501 A1 describe un procedimiento de inducción de múltiples respuestas inmunitarias específicas de epítope administrando una vacuna que comprende un antígeno de tumor y un adyuvante a un sujeto 65 y posteriormente administrando al menos dos dosis de ligando de TLR, que es opcionalmente un oligonucleótido CpG, en una cantidad eficaz para inducir múltiples respuestas inmunitarias específicas de epítope. El adyuvante

puede ser un oligonucleótido CpG.

El documento US 2006/0019923 A1 describe que los ligandos de TLR inertes pueden transformarse en ligandos de TLR inmunoestimulantes combinándolos y administrándolos con complejos inmunoestimulantes. Los ligandos de 5 TLR inertes son preferentemente oligonucleótidos.

El documento WO 2004/016805 A2 describe que las propiedades inmunoestimulantes de los ácidos nucleicos CpG de clase B y de clase C y otros ácidos nucleicos inmunoestimulantes estabilizados pueden mantenerse o incluso mejorarse por la inclusión selectiva de uno o más enlaces no estabilizados entre ciertos nucleótidos. Los enlaces no estabilizados son preferentemente enlaces naturales, es decir, enlaces fosfodiéster o enlaces similares a fosfodiéster.

El documento WO 2005/042018 A2 describe oligonucleótidos que contienen CpG inmunoestimulantes y análogos de oligonucleótidos que tienen una estructura secundaria con una repetición invertida en o próxima al extremo 3' de la molécula. La estructura secundaria implica la formación de estructuras complejas o de mayor orden bajo ciertas condiciones.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere en parte a oligonucleótidos que contienen CpG inmunoestimulantes, en particular a una nueva clase de oligonucleótidos inmunoestimulantes llamados la clase P. Originalmente, la estructura de los oligonucleótidos CpG no se consideró que fuera particularmente importante para la activación inmunitaria, pero posteriormente se supo que los oligonucleótidos que contienen motivos poli G en uno o ambos extremos (clase A) , o oligonucleótidos con un palíndromo en 3' (clase C) , indujeron mayores niveles de activación de células NK y 25 secreción de IFN-α por pDC que los oligonucleótidos sin potencial para formar estructuras secundarias. Los oligonucleótidos de clase A pueden formar estructuras de mayor orden muy complejas tales como nanopartículas (Kerkmann y col., J. Biol Chem. (2005) 280 (9) :8086-93.) , y la clase C puede formar dúplex intermoleculares u horquillas. La presente invención se refiere a la identificación de una nueva subclase de oligonucleótidos CpG, que contiene regiones formadoras de dúplex tales como, por ejemplo, palíndromos perfectos o imperfectos en o próximos a ambos de los extremos 5' y 3', dándoles el potencial de formar concatémeros. Estos oligonucleótidos denominados oligonucleótidos de clase P tienen la capacidad en algunos casos de inducir niveles mucho más altos de secreción de IFN-α que la clase C. Los oligonucleótidos de clase P tienen la capacidad de auto-ensamblarse espontáneamente en concatémeros tanto in vitro como in vivo. Sin desear quedar ligado a teoría particular alguna para el procedimiento de acción de estas moléculas, una posible hipótesis es que esta propiedad dota a los oligonucleótidos de clase P de la capacidad para reticular más altamente TLR9 dentro de ciertas células inmunitarias, induciendo un patrón distinto de activación inmunitaria en comparación con las clases previamente descritas de oligonucleótidos CpG.

Según la invención, el oligonucleótido... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende una mezcla sustancialmente homogénea de oligonucleótidos formadores de dúplex, en la que la mezcla de oligonucleótidos formadores de dúplex se formula en un tampón de baja salinidad e incluye un soluto, en donde al menos el 50 % de los oligonucleótidos formadores de dúplex están presentes en forma monomérica o dimérica y en donde los oligonucleótidos formadores de dúplex son oligonucleótidos inmunoestimulantes que comprenden:

un dominio de activación de TLR en 5' y al menos dos regiones palindrómicas, siendo una región palindrómica una región palindrómica en 5' de al menos 6 nucleótidos de longitud y conectada a una región palindrómica en 3' de al menos 8 nucleótidos de longitud tanto directamente como mediante un espaciador, que es un ácido nucleico que tiene una longitud de 1-50 nucleótidos o un espaciador de no nucleótido, en donde el oligonucleótido incluye al menos un dinucleótido YpR, y en donde el oligonucleótido no es T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G (SEC ID Nº : 335) .

2. La composición de la reivindicación 1, en la que los oligonucleótidos incluyen al menos un dinucleótido CpG no metilado.

3. La composición de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el dominio de activación de TLR es TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT o TTTT.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el dominio de activación de TLR está dentro de la región palindrómica en 5'.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el dominio de activación de TLR está directamente en 5' con respecto a la región palindrómica en 5'.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la región palindrómica en 5' tiene al menos 8 nucleótidos de longitud.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la región palindrómica en 3' tiene al menos 10 nucleótidos de longitud.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que cada oligonucleótido inmunoestimulante formador de dúplex incluye al menos una secuencia formadora de dúplex.

9. La composición de la reivindicación 8, en la que cada oligonucleótido inmunoestimulante formador de dúplex incluye al menos dos secuencias formadoras de dúplex.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la mezcla sustancialmente homogénea incluye al menos dos oligonucleótidos inmunoestimulantes formadores de dúplex diferentes que tienen diferentes secuencias de nucleótidos.

11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que al menos uno de los oligonucleótidos inmunoestimulantes comprende un residuo de azúcar modificado en 2', preferentemente un residuo de azúcar modificado co.

2. O-metilo.

12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el soluto es un aminoácido o un alcohol.

13. Una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en el tratamiento de cáncer.

14. Un procedimiento de preparación de una mezcla sustancialmente homogénea de oligonucleótidos inmunoestimulantes formadores de dúplex, que comprende:

identificar oligonucleótidos inmunoestimulantes formadores de dúplex, formular los oligonucleótidos inmunoestimulantes formadores de dúplex en un tampón de baja salinidad y un soluto para producir una mezcla sustancialmente homogénea de oligonucleótidos, en donde los oligonucleótidos formadores de dúplex son oligonucleótidos inmunoestimulantes como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

15. Una mezcla sustancialmente homogénea de oligonucleótidos inmunoestimulantes formadores de dúplex obtenible mediante el procedimiento de la reivindicación 14.