Composiciones y métodos que emplean polipéptidos de marco de lectura alternativa para el tratamiento de cáncer y enfermedades infecciosas.

Un polipéptido con marco de lectura alternativa aislado (ARF) para cebar células APC ex vivo para provocar una respuesta inmunitaria,

en donde el polipéptido ARF se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos hHER-2 de las SEQ ID NOs. 71 a 95, y fragmentos de los mismos que comprenden por lo menos 9 aminoácidos.

Composiciones y métodos que emplean polipéptidos de marco de lectura alternativa para el tratamiento de cáncer y enfermedades infecciosas Antecedentes de la invención Campo técnico de la invención La presente invención se relaciona de manera general con composiciones y métodos para el tratamiento de cáncer y enfermedades infecciosas. Más específicamente, esta invención provee polipéptidos con marco de lectura alternativa (ARF) , conjugados, y proteínas de fusión; polinucleótidos que codifican polipéptidos (ARF) , conjugados, y proteínas de fusión; y composiciones con base en células presentadoras de antígeno (APC) y células dendríticas (DC) y métodos que emplean polipéptidos ARF y polinucleótidos cuyas composiciones y métodos son útiles en el tratamiento de cáncer y enfermedades infecciosas.

Descripción de la técnica relacionada El dogma central de la biología molecular establece que el ADN genómico se transcribe en ARNm y este se traduce en proteína. De acuerdo con estimaciones recientes, el genoma humano codifica aproximadamente 30.000 a 100.000 ARNm que se traducen en proteínas que, en total, comprenden el proteoma. Harrison et al., Nucl. Acid Res. 30: 1083-1090 (2002) .

Está bien establecido el mecanismo por el cual el ARNm eucariota se traduce en proteína. A través del proceso de barrido de ribosomas, un complejo ribosómico de pre-iniciación 43 S se ensambla en el ARNm 5’ CAP y migra en una dirección 5’ a 3’ a lo largo de la región no traducida (UTR) en un proceso dependiente de ATP. Cuando el complejo 43S encuentra un codón AUG iniciador dentro del contexto adecuado (normalmente el primer AUG de 50 a 100 nucleótidos en dirección 3’ de CAP) , hace una pausa durante un tiempo suficiente para permitir la asociación de la subunidad ribosómica 60S para crear el complejo de iniciación ribosómica que comienza la traducción en el marco de lectura abierto rf0, normal. Véase, Kozak, J. Cell Biol. 108: 229-241 (1989) ; para una revisión, véase también, Gray et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14: 399-458 (1998) .

La maquinaria ribosómica de una célula eucariota puede producir errores en la traducción de ARNm que dan como resultado productos de traducción aberrantes tales como polipéptidos con marco de lectura alternativa (ARF) . Los polipéptidos ARF son productos de traducción codificados en marcos de lectura rf1 y rf2 que se cambian mediante uno o dos nucleótidos, respectivamente, desde el marco de lectura rf0 normal. Debido a que su expresión es baja, los polipéptidos ARF son biológicamente invisibles en la célula; sin embargo, debido a la exquisita sensibilidad de la respuesta de células T citotóxicas (CTL) , los polipéptidos ARF pueden ser inmunogénicos en números de copia muy bajos.

Los polipéptidos ARF se producen de forma entrópica debido a los errores inherentes en la síntesis de proteínas. Yewdell et al., J. Immunol. 157: 1823-1826 (1996) . Los mecanismos mediante los cuales los errores de traducción producen polipéptidos ARF incluyen: (1) iniciación de traducción en la UTR 5’ (Uenaka et al., J. Expresión. Med. 180: 1599-1607 (1994) ) ; (2) desplazamiento de marco del complejo de iniciación de codón AUG rf0 normal de una base (rf1) o dos bases (rf2) directas o una base (rf2) o dos bases (rf1) inversas; (3) barrido a través del codón AUG rf0 normal y formación de un complejo de iniciación en un codón en dirección 3’ (Bullock et al., J. Exp. Med. 186:1051-1058 (1997) ) ; (4) formación de un complejo de iniciación en un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) localizado en dirección 3’ del sitio de entrada ribosómica dependiente de CAP normal (Nanbru et al., J. Biol. Chem. 272:32061-32066 (1997) ; (5) desplazamiento del marco de ribosomas a través de marcos de lectura aleatorios y programados de marcos de lectura rf0 a marcos de lectura rf1 o rf2 (Elliott et al., Eur. J. Immunol. 26:1175-1179 (1996) ; Rom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3959-3963 (1994) ; Farabaugh, Annu. Rev. Genet 30:507-528 (1996) ) ; (6) formación de complejos de iniciación en codones rf1 o rf2 diferentes de AUG, tales como, por ejemplo, ACG o CTG (Shastri etal., J. Biol. Chem. 270:1088-1091 (1995) ; Malarkannan et al., Immunity 10:681-690 (1999) ; y Ronsin et al., J. Immunol. 163:483-490 (1999) ) ; (7) omisión ribosómica de los segmentos de ARNm (Herr et al., Annu. Rev. Biochem. 69:343-372 (2000) ) ; (8) supresión ribosómica de codones de terminación y lectura completa de traducción posterior (Bullock et al., J. Exp. Med. 186:1051-1058 (1997) ) ; y (9) síntesis de polipéptidos de ARF en marcos de lectura 3, 4 y 5 (es decir, rf3, rf4, y rf5) ) que resulta de la traducción de hebras anticodificantes de genes que se expresan a través de transcripción a partir de promotores crípticos) (Van den Eynde et al., J. Exp. Med. 190:1793-1799 (1999) ) .

Luego de la traducción, los polipéptidos ARF son propensos a actuar como sustratos para los transportadores TAP dependientes de ATP, para ser trasladados al lumen del ER, y para ser cargados en las moléculas de clase I del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) unidas a la superficie celular de la célula presentadora de antígeno (APC) . El polipéptido ARF se presenta dentro del contexto de una molécula clase I MHC a las células T CD8 + citotóxicos intactas

(CTL) . Esto estimula la expansión clonal del CTL específico a ARF capaz de identificar y eliminar las células que expresan el polipéptido ARF. Para una revisión, véase, Rock et al., Annu. Rev. Immunol. 17:739-779 (1999) .

La UTR 5’ de muchos genes humanos ayuda a regular la iniciación de traducción del gen estructural. Los codones de iniciación de UTR 5’ alternativos tienen un mecanismo mediante el que se regula la iniciación de la traducción. La UTR 5’ de los genes humanos es una fuente probablemente rica de péptidos Arf debido a este mecanismo regulador. Por ejemplo, el ARNm Jund, que se traduce en una forma dependiente de casquete, inicia en dos AUG dentro del marco, produciendo una proteína de 39 y 34 kDa. El ARNm Jund codifica un AUG fuera de marco que dirige la traducción de un péptido Arf corto así como también tres codones sin AUG también capaces de soportar la iniciación de traducción, los codones ACG y CUG en marco en dirección 3’ del AUG rf0, y un CUG fuera de marco encontrados en la UTR 5’ que deben generar un péptido Arf Short et al., J. Biol. Chem. 277:32697-705 (2002) . Estos codones funcionan para suprimir acumulativamente la traducción 34 kDa. La UTR 5’ de ARNm eIF4GI contiene un AUG fuera de marco que actúa para regular la expresión de eIF4GI y producir un péptido Arf. Byrd et. al., Mol. Cell. Biol. 22:4499-511 (2002) .

Otros mecanismos pueden contar para la producción de Arf en genes humanos. Por ejemplo, C-y L-Myc (Joplin et. al., RNA 10:287-98 (2004) y Cencig et. al., Oncogene 23:267-77 (2004) ) el receptor de angiotensina II tipo 1 ( (Martin et. al., Mol. Cell. Endocrinol. 30:51-61 (2003) ) ; y HSP70 (Rubtsova et. al., (2003) ) inician la traducción a través de secuencias IRES 5’-UTR de una manera independiente de CAP. El corte y empalme alternativo en el UTR 5’ también dará lugar a péptidos novedosos.

Se han identificado CTLs CD8+ específicos para ARF derivados de linfocitos que infiltran tumores (TIL) en pacientes con melanoma y carcinoma de células renales. Wang et al. J. Exp. Med. 183: 1131-1140 (1996) ; Moreau-Aubr y et al. J. Exp. Med. 191:1617-1623 (2000) ; Rosin et al. J. Immunol. 163:483-490 (1999) ; y Probst-Kepper et al. J. Exp. Med. 193:11891198 (2001) . Sólo se ha identificado un pequeño número de antígenos tumorales por los CTL derivados de TIL; sin embargo, un número sustancial de aquellos identificados surgen de polipéptidos ARF. Rosenberg, Inmunología Today 18: 175-182 (1997) . Por ejemplo, se ha identificado un polipéptido ARF utilizando un clon de linfocito de un paciente que exhibe regresión completa de metástasis de melanoma. Rosenberg et al. J. Immunol. 168a: 2402-2407 (2002) .

Aunque se ha descrito la existencia de polipéptidos con marco de lectura alternativa, no se ha apreciado que los polipéptidos ARF se puedan emplear en composiciones y métodos para estimular una respuesta inmunitaria protectora específica para antígenos de cáncer y/o enfermedades infecciosas.

Resumen de la invención La presente invención aborda estas y otras necesidades relacionadas al proveer polipéptidos con marco de lectura alternativa (ARF) , conjugados, y proteínas de fusión y polinucleótidos que codifican polipéptidos (ARF) y proteínas de fusión. También se proveen vectores con base en ADN y ARN así como también sistemas con base en APC/DC para el suministro in vivo... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido con marco de lectura alternativa aislado (ARF) para cebar células APC ex vivo para provocar una respuesta inmunitaria, en donde el polipéptido ARF se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos hHER-2 de las SEQ ID NOs. 71 a 95, y fragmentos de los mismos que comprenden por lo menos 9 aminoácidos.

2. El polipéptido ARF aislado de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha respuesta inmunitaria es una respuesta de célula T citotóxica (CTL) .

3. Una proteína de fusión que comprende dos o más polipéptidos ARF en donde cada uno es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, o es una variante de la misma que comprende por lo menos 70% de identidad de secuencia con un polipéptido ARF de la reivindicación 1 o 2 y capaz de cebar células APC ex vivo para provocar una respuesta inmunitaria dirigida contra hHER-2.

4. Un conjugado de polipéptido, que comprende una unidad estructural de terminal N y una unidad estructural de terminal C en donde dicha unidad estructural de terminal N o C comprende uno o más polipéptidos ARF y dicha unidad estructural de terminal C o N restante comprende una unidad estructural de polipéptido que facilita la unión de dicho polipéptido ARF a una célula presentadora de antígeno (APC) en donde dicho polipéptido ARF es como se define de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. El conjugado de polipéptido de la reivindicación 4 en donde dicha unidad estructural de polipéptido que facilita la unión se selecciona del grupo que consiste de ligando GM-CSF, IL-1, TNF, IL-4, CD40L, CTLA4, CD28, y FL T-3.

6. Una composición inmunogénica, que comprende una célula presentadora de antígeno (APC) pulsada ex vivo con un polipéptido ARF aislado como se define de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

7. Una composición inmunogénica, que comprende una célula presentadora de antígeno (APC) pulsada ex vivo con una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3.

8. Una composición inmunogénica, que comprende una célula presentadora de antígeno (APC) pulsada ex vivo con un conjugado de proteína de acuerdo con la reivindicación 4 o reivindicación 5.

9. Un polipéptido ARF de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, un conjugado de acuerdo con la reivindicación 4 o reivindicación 5 y/o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3, para uso en un método para tratar cáncer al provocar una respuesta inmunitaria en un paciente, comprendiendodicho método las etapas de:

(a) obtener de dicho paciente una muestra que contiene células presentadoras de antígeno (APCs) ;

(b) aislar a partir de dicha muestra dichas APC;

(c) cebar dichas APC aisladas ex vivo con el polipéptido ARF, conjugado y/o proteína de fusión en donde las APC cebadas son capaces de estimular una respuesta inmunitaria in vivo; y

(d) administrar dichas APC al paciente.

10. Uso de un polipéptido ARF de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, un conjugado de acuerdo con la reivindicación 4 o reivindicación 5 y/o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3 en la fabricación de una composición para uso en el tratamiento de cáncer al provocar una respuesta inmunitaria en un paciente, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) obtener de dicho paciente una muestra que contiene células presentadoras de antígeno (APCs) ;

(b) aislar a partir de dicha muestra dichas APC;

(c) cebar dichas APC aisladas ex vivo con dicho polipéptido ARF, conjugado y/o proteína de fusión en donde las APC cebadas son capaces de estimular una respuesta inmunitaria in vivo; y

(d) administrar dichas APC al paciente.

11. Un polipéptido ARF de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, un conjugado de acuerdo con la reivindicación 4 o reivindicación 5 y/o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3 para uso en un método para tratar cáncer al inhibir la proliferación de una célula tumoral en un paciente con cáncer, comprendiendodicho método las etapas de:

(a) obtener de dicho paciente con cáncer una muestra que contiene células presentadoras de antígeno (APCs) ;

(b) aislar a partir de dicha muestra dichas células presentadoras de antígeno;

(c) cebar dichas células presentadoras de antígeno aisladas (APCs) ex vivo con dicho polipéptido ARF, conjugado y/o proteína de fusión en donde las APC cebadas son capaces de estimular una respuesta inmunitaria in vivo; y

(d) administrar dichas APC cebadas a dicho paciente con cáncer.

12. Uso de un polipéptido ARF de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, un conjugado de acuerdo con la reivindicación 4 o reivindicación 5 y/o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3 en la fabricación de una composición para uso en el tratamiento de cáncer al inhibir la proliferación de una célula tumoral en un paciente, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) obtener de dicho paciente con cáncer una muestra que contiene células presentadoras de antígeno (APCs) ;

(b) aislar a partir de dicha muestra dichas células presentadoras de antígeno;

(c) cebar dichas células presentadoras de antígeno aisladas (APCs) ex vivo con dicho polipéptido ARF, conjugado y/o proteína de fusión, en donde las APC cebadas son capaces de estimular una respuesta inmunitaria in vivo; y

(d) administrar dichas APC cebadas a dicho paciente con cáncer.

13. El polipéptido ARF, conjugado o proteína de fusión de acuerdo con reivindicaciones 9 o 11 en donde dicha respuesta inmunitaria es una respuesta de célula T citotóxica.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 10 o 12 en donde dicha respuesta inmunitaria es una respuesta de célula T citotóxica.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 en donde dicha respuesta de célula T citotóxica se dirige específicamente contra una célula tumoral que expresa un antígeno.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 10 o 12 en donde dichas APC son células dendríticas (DCs) .

17. El polipéptido ARF, conjugado o proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 11 o reivindicación 13 cuando depende de la reivindicación 11, o uso de acuerdo con la reivindicación 12, o reivindicaciones 14 a 16 cuando depende de la reivindicación 12, en donde dicha célula tumoral es de un cáncer seleccionado del grupo que consiste de un sarcoma de tejido blando, un linfoma, cáncer del cerebro, cáncer del esófago, cáncer del útero, cáncer del cuello uterino, cáncer del hueso, cáncer del pulmón, cáncer del endometrio, cáncer de la vejiga, cáncer de mama, cáncer de laringe, cáncer de colon/recto, cáncer de estómago, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de la glándula suprarrenal, y cáncer de próstata.

18. Un vector que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido ARF de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3 para uso en un método para tratar cáncer al provocar una respuesta inmunitaria en un paciente, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) obtener de dicho paciente una muestra que contiene células presentadoras de antígeno (APCs) ;

(b) aislar a partir de dicha muestra dichas APC;

(c) cebar dichas APC aisladas ex vivo con dicho vector en donde dichas APC cebadas son capaces de estimular una respuesta inmunitaria in vivo; y

(d) administrar dichas APC cebadas al paciente, en donde dicho vector se selecciona del grupo que consiste de un vector adenoviral, un vector retroviral, y un vector viral adenoasociado.

19. Uso de un polinucleótido que codifica un polipéptido ARF de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3, en la fabricación de un vector para uso en el tratamiento de cáncer en un paciente al provocar una respuesta inmunitaria en un paciente, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) obtener de dicho paciente una muestra que contiene células presentadoras de antígeno (APCs) ;

(b) aislar a partir de dicha muestra dichas APC;

(c) cebar dichas APC aisladas ex vivo con dicho vector en donde dichas APC cebadas son capaces de estimular una respuesta inmunitaria in vivo; y

(d) administrar dichas APC cebadas al paciente, en donde dicho vector se selecciona del grupo que consiste de un vector adenoviral, un vector retroviral, y un vector viral adenoasociado.

20. Un polipéptido ARF de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, un conjugado de acuerdo con la reivindicación 4 o reivindicación 5 y/o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3 para uso en el tratamiento de cáncer en un paciente al provocar una respuesta inmunitaria en un paciente, en donde dicho polipéptido ARF, conjugado, y/o proteína de fusión es capaz de estimular una respuesta inmunitaria in vivo.

21. Uso de un polipéptido ARF de acuerdo con 1 a 2, un conjugado de acuerdo con la reivindicación 4 o reivindicación 5 y/o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3 en la fabricación de una composición para uso en un método para tratar cáncer al provocar una respuesta inmunitaria en un paciente, en donde dicho polipéptido ARF, conjugado, y/o proteína de fusión es capaz de estimular una respuesta inmunitaria in vivo.

22. Un vector que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido ARF de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3 para uso en el tratamiento de cáncer al provocar una respuesta inmunitaria en un paciente, en donde dicho polipéptido ARF y/o proteína de fusión es capaz de estimular una respuesta inmunitaria in vivo.

23. Uso de un polinucleótido que codifica un polipéptido ARF de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3 en la fabricación de un vector para uso en el tratamiento de cáncer al provocar una respuesta inmunitaria en un paciente, en donde dicho polipéptido ARF y/o proteína de fusión es capaz de estimular una respuesta inmunitaria in vivo.