SE DESVELAN UNA COMPOSICION, UN EQUIPO Y UN PROCEDIMIENTO PARA SEPARAR CELULAS.

EL EQUIPO INCLUYE UN RECIPIENTE CENTRIFUGABLE Y UNA SUSPENSION SEPARADORA DE CELULAS BASADA EN PARTICULAS DE SILICE ORGANOSILANIZADA QUE SIRVE PARA LA SEPARACION DEL GRADIENTE DE DENSIDAD, QUE CONTIENE UN POLIACTAM Y ESTA ESTERILIZADA POR TRATAMIENTO CON RADIACION IONIZANTE. LA COMPOSICION INCLUYE UNA SUSPENSION BASADA EN PARTICULAS DE SILICE PARA LA SEPARACION DE CELULAS QUE CONTIENE AL MENOS EL 0,05% DE UN POLIACTAM Y ESTA TRATADA PREFERENTEMENTE POR RADIACION IONIZANTE. TAMBIEN SE DESVELA UN PROCEDIMIENTO PARA AISLAR CELULAS SANGUINEAS RARAS DE UNA MEZCLA DE CELULAS SANGUINEAS.

Composición, equipo y método para la separación de células Campo de la invención La presente invención se refiere a composiciones, equipos y métodos para la separación celular.

Antecedentes de la invención

La separación de células y de componentes celulares, que ha sido durante tiempo una herramienta importante en la investigación básica y las aplicaciones de diagnóstico, está recibiendo cada vez más importancia en el ámbito clínico. El uso de métodos de trasplantación de células, tales como el trasplante de médula ósea, en la terapéutica humana, exige procedimientos de separación de células que no sólo sean rápidos y reproducibles, sino que también produzcan una composición celular viable, segura y no tóxica. También es deseable que dichos procedimientos de aislamiento sean adecuados para el aislamiento de células que son relativamente escasas. Por ejemplo, después de la quimioterapia para ciertos tipos de cáncer, muchos pacientes reciben ahora "trasplantes de células madre", que consisten en una fracción enriquecida de células progenitoras hematopoyéticas, aisladas a partir de diversos tejidos, tales como la médula ósea, la sangre periférica o la sangre del cordón umbilical. Tales células progenitoras constituyen solo aproximadamente el 1% del número total de células presentes en estos tejidos.

La centrifugación en gradiente de densidad es una técnica muy utilizada para separar y aislar células y componentes celulares. Este método utiliza el fenómeno de división de las células en un medio con una densidad definida de acuerdo con su densidad de flotación. Un medio tal puede ser una solución o una suspensión de micropartículas. Ejemplos de los medios de uso común en la separación por gradiente de densidad incluyen sacarosa, dextrano, albúmina sérica bovina (BSA) , diatrizoato de FICOLL (Pharmacia) , metrizoato de FICOLL (Nycomed) , PERCOLL® (Pharmacia) , metrizamida y sales pesadas, tales como cloruro de cesio. La exposición de las células a muchos de estos medios produce una alteración de la función biológica de las células y/o una contaminación de la preparación por los componentes tóxicos. Por ejemplo, de BSA y FICOLL se sabe que causan una agregación celular no deseada, a pH fisiológico. Además, estos medios no son generalmente susceptibles de esterilización en autoclave o de radiación en "forma definitiva" - es decir, en una concentración, una solución iónica y un recipiente que está listo para su uso en el aislamiento de un tipo de célula particular.

Un medio de separación celular que ha sido ampliamente utilizado en la preparación de fracciones de células sanguíneas es el PERCOLL® (una marca registrada de Pharmacia Fine Chemicals) . El PERCOLL® es una partícula de sílice coloidal, tratada por un proceso de curado para formar una capa de recubrimiento de polivinilpirrolidona sobre cada partícula. Mientras que el PERCOLL® es bastante estable a pH fisiológico, hay algunas limitaciones de su utilidad general en el aislamiento de células para fines terapéuticos. Por ejemplo, el medio es difícil de esterilizar, ya que no es estable frente al autoclave o la radiación ionizante, después de que se diluye en una solución salina fisiológica. Estas propiedades limitan la utilidad del producto para aplicaciones clínicas que implican la reintroducción de células separadas en seres humanos o en cualquier otro lugar en donde se requiere finalmente material esterilizado.

El documento de patente de EE.UU. nº 4.927.749 proporciona una preparación de partículas de sílice coloidal organosilanizado (PSCO) para la separación en gradiente de densidad, que supera algunos de los problemas descritos anteriormente. Aunque es estable frente a la esterilización con calor y la radiación ionizante cuando se diluye en una solución salina fisiológica, cuando se esteriliza con radiación ionizante, las preparaciones de partículas de SCO son tóxicas para ciertos tipos de células raras, tales como las células dendríticas, los linfocitos citolíticos naturales, los linfocitos supresores naturales, los linfocitos T citotóxicos y en particular, las células progenitoras hematopoyéticas (CD34+) . Puesto que la esterilización final mediante radiación ionizante puede ser preferible para ciertas aplicaciones, en especial las relacionadas con la inclusión del material en recipientes de plástico fungibles, el uso de este material para aplicaciones clínicas puede estar limitado. Además, se ha comprobado que el material induce la aglutinación o la agregación de las células, lo que reduce significativamente el rendimiento en estas células raras en forma funcional.

La presente invención proporciona composiciones y métodos que son especialmente adecuados para el aislamiento de fracciones de células "raras" - por ejemplo, tipos de células que constituyen menos de aproximadamente el 1% del total de células en una población celular. En particular, la invención incluye un medio de separación celular con sílice coloidal que mejora el rendimiento y el potencial funcional de las células, mediante la reducción de la agregación celular y la toxicidad celular. El descubrimiento de la presente invención es que la inclusión de una polilactama, tal como la gamma polilactama polivinilpirrolidona (PVP) , en la solución en la que se suspende el material del gradiente de densidad con sílice coloidal, reduce notablemente la agregación de las células sanguíneas poco frecuentes, dando lugar a mejores rendimientos. Otro descubrimiento de la presente invención es que la adición de la polilactama al medio, evita la pérdida de potencial clonogénico durante el aislamiento en gradiente de densidad, de ciertas células progenitoras hematopoyéticas, mediante la reducción de la toxicidad inducida por radiación de las soluciones de SCO.

La invención también proporciona métodos para el aislamiento de determinados tipos celulares que son importantes en los métodos diagnósticos y terapéuticos - incluyendo, por ejemplo, células progenitoras hematopoyéticas (CD34+) aisladas a partir de la médula ósea, células tumorales seleccionadas, células dendríticas, linfocitos citolíticos naturales (NK, del inglés “natural killer”) , linfocitos T citotóxicos (CTL) y linfocitos supresores naturales. La invención también proporciona el agotamiento de los tipos de células que pueden interferir con un resultado clínico particular, tales como los CTL.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención incluye composiciones para uso en la separación celular que consisten en un medio para la separación de células a base de partículas de sílice coloidal silanizado, que contiene al menos aproximadamente 0, 05% de polilactama, tal como polivinilpirrolidona (PVP) , presente en una concentración entre aproximadamente 0, 1 y aproximadamente 10 por ciento. En una realización preferida, el medio de separación se compone de una suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado. Una ventaja de esta composición es que se puede esterilizar, mediante esterilización en autoclave o mediante radiación ionizante, sin transmitir efectos tóxicos a las células que se separan posteriormente en la misma.

Aunque las partículas que comprenden los medios de la invención pueden tener un diámetro que varía desde aproximadamente 0, 003 a 50 micrómetros, las partículas de sílice coloidal tienen por lo general un diámetro promedio de 10-50 nm.

Las composiciones de la invención son especialmente adecuadas para el uso en el aislamiento de una célula sanguínea rara seleccionada, a partir de una mezcla de células. De acuerdo con los métodos descritos en esta memoria, en estos casos, el medio se prepara de tal manera que la suspensión de partículas tiene una densidad específica de aproximadamente 0, 0005 g/ml de dicha célula seleccionada. Ejemplares de tipos de células raras incluyen las células progenitoras hematopoyéticas CD34+, las células dendríticas, los linfocitos citolíticos naturales, los linfocitos supresores naturales, los linfocitos T citotóxicos, las células tumorales y las células nucleadas del feto.

Las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ se pueden aislar a partir de células mononucleares de la sangre periférica, en cuyo caso la suspensión preferida de partículas de sílice coloidal organosilanizado tiene una densidad específica de 1, 0605 g/ml. Cuando las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ se aíslan a partir de células de la médula ósea, la suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado tiene una densidad específica de...

1. Una composición para uso en la separación celular, que comprende un medio de separación de células a base de partículas de sílice coloidal silanizado que contiene al menos aproximadamente 0, 05% de polilactama, en donde dicho medio de separación que contiene dicha polilactama está esterilizado.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho medio de separación de células a base de partículas de sílice coloidal está compuesto de partículas de sílice organosilanizado.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha composición se esteriliza en un autoclave o mediante radiación ionizante.

4. La composición de acuerdo la reivindicación 3, en donde dicha radiación ionizante se selecciona entre la radiación gamma y la radiación por haz de electrones.

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha polilactama es polivinilpirrolidona presente a una concentración entre aproximadamente 0, 1 y aproximadamente 10 por ciento.

6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha partícula es una microesfera que tiene un diámetro entre aproximadamente 0, 003 y 50 micrómetros.

7. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el aislamiento de una célula sanguínea rara seleccionada a partir de una mezcla de células, en donde dicha suspensión de partículas de sílice coloidal silanizado tiene una densidad específica dentro de aproximadamente ± 0, 0005 g/ml de dicha célula seleccionada.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la célula sanguínea rara se selecciona entre el grupo consistente en células progenitoras hematopoyéticas CD34+, células dendríticas, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos supresores naturales, linfocitos T citotóxicos, células tumorales y células fetales nucleadas.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha célula sanguínea rara es una célula progenitora hematopoyética CD34+, dicha mezcla celular comprende células mononucleares de sangre periférica, y dicha suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado tiene una densidad específica de 1, 0605 g/ml.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha célula sanguínea rara es una célula progenitora hematopoyética CD34+, dicha mezcla de células consiste en células de la médula ósea, y dicha suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado tiene una densidad específica de 1, 0685 g/ml.

11. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha célula sanguínea rara es una célula dendrítica, dicha mezcla celular comprende células mononucleares de sangre periférica y dicha suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado tiene una densidad específica seleccionada entre el grupo consistente en 1, 0770 g/ml, 1, 0720 g/ml, 1, 0650 g/ml, 1, 0610 g/ml y 1, 0565 g/ml.

12. Un equipo para la separación de células que comprende un recipiente centrifugable y una suspensión para la separación de células a base de partículas de sílice coloidal silanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Un método para estilizar un medio de separación de células a base de partículas de sílice silanizado que comprende someter dicho medio de preparación a autoclave o a radiación iónica en presencia de al menos aproximadamente 0, 05 por ciento de polilactama.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha polilactama es polivinilpirrolidona presente en una concentración entre aproximadamente 0, 1 y aproximadamente 10 por ciento.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en donde dicha partícula de sílice es una partícula de sílice coloidal organosilanizado.

16. Un método para aislar una célula sanguínea rara seleccionada a partir de una mezcla de células que comprende disponer en capas la mezcla que contiene dicha célula hematopoyética rara sobre un medio de separación de células a base de partículas de sílice coloidal silanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y centrifugar dicha mezcla con una fuerza centrífuga suficiente para sedimentar las células que tienen una densidad específica que es superior a la densidad específica de la célula seleccionada.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha mezcla que contiene dicha célula rara y dicho medio de separación de células está contenida en un tubo de centrifugación que tiene paredes laterales y un parte inferior cerrado, un miembro de constricción dispuesto dentro del tubo, estando dicho miembro de constricción situado y montado de modo que retenga líquido en la porción inferior del tubo por debajo del miembro de constricción, cuando el tubo se invierte, y en donde dicho medio de separación de células tiene una densidad específica dentro de ± 0, 0005 g/ml de la densidad específica del tipo celular seleccionado y dicho medio está contenido en la

parte inferior del tubo y se extiende por encima de dicho miembro de constricción hasta un nivel superior a una abertura formada por dicho miembro de constricción, de modo que estas células que se capturan después de la centrifugación en una interfase entre el medio de separación celular y un medio de densidad inferior, se descargan con el medio de densidad inferior cuando el tubo se invierte.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dicho tubo incluye una parte superior cerrada, un primer orificio en dicha parte superior a través del cual se puede introducir material líquido en el tubo, un segundo orificio en dicha parte superior y un canal cerrado para fluido que comunica el segundo orificio con la parte inferior del tubo, por debajo de dicho miembro de constricción.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la célula rara seleccionada es una célula progenitora hematopoyética funcional, la mezcla de células es una mezcla de células mononucleares de sangre periférica y la densidad específica de la suspensión del gradiente de densidad para la separación de las células es 1, 0605 g/ml.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la célula rara seleccionada es una célula progenitora hematopoyética funcional, la mezcla de células es una mezcla de células de la médula ósea y la densidad específica de la suspensión del gradiente de densidad para la separación de células es 0, 0685 g/ml.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la célula sanguínea rara seleccionada es una célula tumoral, la mezcla de células se obtiene a partir de la sangre o de la médula ósea, y en donde el medio para la separación de células tiene una densidad específica seleccionada en el intervalo de 1, 0490-1, 0580 g/ml.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la célula sanguínea rara seleccionada es una célula dendrítica y en donde dicho medio para la separación de células tiene una densidad específica seleccionada entre el grupo consistente en 1, 0770 g/ml, 1, 0720 g/ml, 1, 0650 g/ml, 1, 0610 g/ml y 1, 0565 g/ml.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la célula sanguínea rara es un linfocito T citotóxico y en donde dicho medio de separación de las células tiene una densidad específica seleccionada entre el grupo consistente en 1, 0720 g/ml, 1, 0610 g/ml y 1, 0565 g/ml.

24. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, que incluye adicionalmente la adición a la mezcla de células de una suspensión que incluye una partícula de sílice silanizada a la que se fija una molécula que se une específicamente a un antígeno celular.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, para uso en el agotamiento de linfocitos T, en donde dicha molécula que une específicamente a un antígeno celular, se une a un antígeno presente sobre dichos linfocitos T.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde dicha molécula que se une específicamente a un antígeno celular se selecciona entre el grupo consistente en anticuerpos monoclonales de ratón anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD8.