Celulasas, genes que las codifican y usos de las mismas.

Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipeptido que tiene la actividad enzimatica de la celulasa,

estando dicha secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de nucleotidos aislada que codifica un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N° 31 o 33, o de la Figura 19 o 21;

(b) una secuencia de nucleotidos aislada que comprende la secuencia de codificación de la secuencia de nucleotidos de SEC ID N° 30 o 32, o de la Figura 19 o 21;

(c) una secuencia de nucleótidos aislada que comprende la secuencia de codificación del inserto de ADN contenido en DSM 11024, DSM 11012, DSM 110250 DSM 11014;

(d) una secuencia de nucleótidos aislada, cuya secuencia de codificación difiere de la secuencia de codificación de la secuencia de nucleótidos de uno cualquiera de (a) a (c) debido a la degeneración del código genetico; y

(e) una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipeptido que tiene actividad de celulasa y que tiene una secuencia de aminoacidos que muestra al menos 80 % de identidad con la secuencia de SEC ID N° 31 o 33, o la Figura 19 o 21.

Celulasas, genes que las codifican y usos de las mismas Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de la celulasa, a un vector que contiene la secuencia de nucleótidos, a una célula hospedadora transformada con el vector y a un proceso de producción de un polipéptido mediante el cultivo de dicha célula hospedadora. Además, la invención se refiere a una preparación enzimática que comprende el polipéptido y al uso del preparado en el biolavado a la piedra de productos textiles o prendas que contienen algodón, para el bioacabado de los materiales textiles, en composiciones detergentes, para el tratamiento de pulpa o fibra derivada de la madera y para mejorar la calidad de piensos animales.

Técnica relacionada

La celulosa es un polisacárido lineal de restos de glucosa unidos por enlaces p-1,4. En la naturaleza, la celulosa está normalmente asociada con la lignina junto con hemicelulosas tales como xilanos y glucomananos. El uso práctico de las celulasas se ha visto dificultado por la naturaleza de las celulasas conocidas, que a menudo son mezclas de celulasas que tienen una variedad de actividades y especificidades por sustratos. Por esta razón, es deseable identificar las fuentes de las que se pueden obtener las celulasas que solo tienen las actividades deseadas.

En la técnica, se conoce una amplia variedad de celulasas, la mayoría de las cuales son celulasas ácidas. Sin embargo, también se han identificado algunas celulasas neutras y alcalinas. Celluzyme® es un preparado de celulasa disponible en el mercado que procede de Humicola insolens (Novo Nordisk, AIS). Los documentos GB 2.75.28 y EP 46.314 describen el uso de una celulasa de Humicola insolens como aditivo enzimático en un detergente de lavado para reducir la dureza (rigidez) de los productos textiles que contienen algodón. En los documentos WO 93/11249 y EP 531.372, se describe la clonación de una celulasa que contiene la actividad de endoglucanasa de Humicola insolens. El documento EP 51.91 describe una celulasa de Bacillus sp. NCIMB 425 que es útil en las composiciones detergentes. El documento EP 22.16 describe celulasas que son útiles como agentes de aclarado de los tejidos de color. El documento WO 94/7998 describe celulasas modificadas que poseen una actividad alcalina mejorada. El documento WO 95/2675 describe composiciones detergentes que contienen dos celulasas diferentes: una primera de celulasa que es catalíticamente susceptible a la eliminación de la las partículas de suciedad, y una segunda celulasa que es catalíticamente susceptible a al aclarado del color. El documento WO 92/18599 describe un preparado de detergente que contiene tanto una celulasa como una proteasa. Las celulasas también se han usado industrialmente como ayuda para la eliminación de pasta de impresión espesante y el exceso de colorante tras la impresión textil (EP 576 526).

El documento EP 383 828 describe composiciones detergentes granulares que contienen agente tensioactivo, un material de arcilla suavizante de tejidos y granulados de celulasa que contienen carbonato de calcio. El documento US 5.433.75 describe composiciones detergentes que contienen un agente tensioactivo, un sistema coadyuvante, una arcilla suavizante, un agente floculante de arcilla y una celulasa de alta actividad, preferentemente celulasa de Humicola insolens. El documento US 5.52.838 describe composiciones detergentes granulares que comprenden agente tensioactivo, un coadyuvante y una celulasa, preferentemente una celulasa de Humicola insolens, estando dichas composiciones en una forma compacta, que tiene una densidad relativamente alta y que contiene una baja cantidad de sal de carga inorgánica.

Las enzimas celulasas se usan en una amplia variedad de industrias, además de la industria textil. Por ejemplo, las celulasas se usan industrialmente para el destintado de periódicos y revistas (EP 521.999), para mejorar el drenaje de la pulpa (WO 91/14822, WO 91/17243) y como tratamiento para piensos animales.

Las propiedades exclusivas de cada celulasa hacen que algunas sean más adecuadas para determinados fines que otras. Aunque las enzimas difieren en una serie de aspectos, una de las diferencias más importantes es el pH óptimo. Las celulasas neutras tienen actividad celulasa útil en el intervalo de pH de 6-8 y las celulasas alcalinas tienen actividad celulasa útil en el intervalo de pH de 7,5-1. Las celulasas ácidas son activas en el intervalo de pH de 4,5-6, pero tienen una baja actividad celulasa a valores de pH altos.

Las celulasas neutras y ácidas son especialmente útiles en la industria textil. Klahorst, S. et al, Textile Chemist and Colorist 26:13-18, 1994; Nilsson, T. E., Aachen Textile Conference, DWI Reports 114:85-88 (1995); Videbaek, T. et al., ITB Dyeing/Printing/Finishing, enero de 1994, pág. 25-29; Klahorst, S. et al, AATCC Int. Conf. & Exhibit, 4-7 de octubre de1992, pág. 243, Atlanta, GA; Kochavi, D. et al., Am. Dyestuff Resporter, septiembre de 199, pág. 26-28; Tyndall, R. Michael, Textile Chemist and Colorist 24:23 (1992); Lange, N. K., en Proc. Second TR1CEL Symp. on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases, Espoo, Finlandia, 1993, ed. P. Suominen et al., Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research vol. 8,1993, pág. 263-272. Cuando se usan en el tratamiento de productos textiles, las celulasas atacan las cadenas de las moléculas de celulosa que forman las fibras de

algodón, afectando de esta manera a las características del tejido.

El documento WO 95/24471 se refiere a variantes de una familia de 7 celulasas que comprenden un núcleo y, opcionalmente, un enlace C-terminal de 1 aminoácidos o menos. Las celulasas muestran una mejor actividad enzimática en el intervalo de pH alcalino, mientras que ejercen una acción celulolítica moderada en el sustrato de celulosa. El documento desvela una secuencia de aminoácidos de una endoglucanasa de una cepa de Myceliophthora thermophila. El documento también se refiere al uso de las variantes de celulasa en composiciones detergentes, especialmente para la eliminación de la suciedad o el aclarado del color o la prevención de la retrotinción; en suavizantes de productos textiles; para el biopulido de productos textiles; para mejorar el drenaje de la pulpa de papel; y para la degradación vegetal.

El documento WO 89/9259 se refiere a un preparado de celulasa útil para reducir la aspereza de los productos textiles que contienen algodón y para reducir la velocidad a la que los productos textiles se vuelven ásperos, que comprende aproximadamente 4 % o más, en base al contenido de proteína total, de un componente de endoglucanasa con una actividad endoasa alta y afinidad hacia la celulosa. La celulasa se obtiene de una cepa de Humicola, Trichoderma, Myceliophthora, Penlcillinum, Irpex, Aspergillus, Sulpalidium o Fusarium.

El documento US 4.16.989 se refiere a una celulasa termoestable de Sporotrichum cellulophilum y a un método de producción de la misma. La celulasa termoestable hidrollza la celulosa a una temperatura elevada y produce glucosa y otros subproductos útiles. La celulasa termoestable se encontró en un caldo de cultivo de un hongo perteneciente a Sporotrichum cellulophilum.

El documento US 3.438.864 se refiere a un método de producción de una celulasa mediante el cultivo de una cepa de un moho de Eumyces en un medio líquido estéril que comprende fuentes de carbono y nitrógeno. El documento desvela que el medio de cultivo de Myriococcum albomyces ATCC 16425 contiene una enzima disgregante de la celulosa y también una sustancia de antibiótico. Se saló el medio de cultivo filtrado y centrifugado para hacer precipitar la enzima celulasa. El documento no describe el aislamiento ni la purificación de ninguna enzima celulasa de Myriococcum albomyces.

El documento DE 1767773 se refiere a un método de preparación de una celulasa mediante el cultivo de una cepa de Trichoderma, Myrothecium, Penicillinum, Apergillus, Chaetomium, Xylaha, Polyporous o Trametes en condiciones ácidas.

El documento WO 91/17244 describe una enzima degradante de la celulosa o la hemicelulosa que se puede obtener de un hongo distinto de Trichoderma o Phnerochaete, y que comprende un dominio de unión a hidratos de carbono homólogo a una región A terminal de las celulasas de Trichoderma reesei. El dominio de unión a hidratos de carbono comprende la secuencia de aminoácidos (a) o una subsecuencia de la misma que es capaz de efectuar la unión de la enzima a un sustrato celulósico o hemicelulósico insoluble.

Tradicionalmente, en el lavado a la piedra, se han usado piedras pómez para cambiar las características... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de la celulasa, estando dicha secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° 31 o 33, o de la Figura 19 o 21;

(b) una secuencia de nucleótidos aislada que comprende la secuencia de codificación de la secuencia de nucleótidos de SEC ID N° 3 o 32, o de la Figura 19 o 21;

(c) una secuencia de nucleótidos aislada que comprende la secuencia de codificación del inserto de ADN contenido en DSM 1124, DSM 1112, DSM 1125 o DSM 1114;

(d) una secuencia de nucleótidos aislada, cuya secuencia de codificación difiere de la secuencia de codificación de la secuencia de nucleótidos de uno cualquiera de (a) a (c) debido a la degeneración del código genético, y

(e) una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido que tiene actividad de celulasa y que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 8 % de identidad con la secuencia de SEC ID N° 31 o 33, o la Figura 19 o 21.

2. La secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, que es ARN.

3. La secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1, que es ADN.

4. El ADN de la reivindicación 3, que es ADN genómico o ADNc.

5. Un vector que contiene la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El vector de la reivindicación 5, en el que la secuencia de nucleótidos está ligada operativamente a las secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células huésped procariotas o eucariotas.

7. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 5 o 6.

8. La célula huésped de la reivindicación 7, que pertenece a hongos filamentosos.

9. La célula huésped de la reivindicación 7 u 8, que pertenece al género Tríchoderma o Aspergillus.

1. La célula huésped de la reivindicación 9, que es Tríchoderma reesei.

11. Un proceso de producción de un polipéptido que tiene actividad de celulasa que comprende las etapas de cultivar la célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 1 y recuperar la proteína del medio de cultivo.

12. Un polipéptido que tiene la actividad de celulasa y que está codificado por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el vector de la reivindicación 5 o 6 y que se obtiene mediante el proceso de la reivindicación 11.

13. Una preparación enzimática que comprende un polipéptido que tiene actividad de celulasa codificado por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1.

14. La preparación enzimática de la reivindicación 13 que es líquida.

15. La preparación enzimática de la reivindicación 13 o 14 que está seca.

16. Un método de biolavado a la piedra que comprende la etapa de añadir la preparación enzimática de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 a tejidos o prendas que contienen algodón.

17. El método de la reivindicación 16, en el que el tejido o las prendas son de tela vaquera

18. El método de la reivindicación 16 o 17, en el que la preparación comprende uno o más de los polipéptidos de la reivindicación 12.