Nueva proteasa fúngica y utilización de la misma.

Enzima serina proteasa fúngica, caracterizada porque dicha enzima presenta actividad de la serina proteasa ycomprende una secuencia de aminoácidos de la enzima Fe_RF6318 madura tal como se define en la SEC.

ID. nº:15o una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 86% de identidad con la secuencia de aminoácidos dela enzima Fe_RF6318 madura definida en la SEC. ID. nº:15.

Nueva proteasa fúngica y utilización de la misma.

Campo de la invención La presente invención se refiere a una enzima serina proteasa fúngica útil en diversas aplicaciones, en particular en detergentes de lavandería y lavavajillas. La invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica dicha enzima, a un vector recombinante, a una célula anfitriona para la producción de dicha enzima, a una composición enzimática que comprende dicha enzima, así como a un procedimiento para la preparación de dicha composición. Esta invención se refiere también a diversas utilizaciones de dicha enzima o a las composiciones que comprenden dicha enzima.

Antecedentes

Las proteasas microbianas están entre las enzimas hidrolíticas más importantes y encuentran aplicaciones en diversos sectores industriales, tales como detergentes, alimentos, piel, productos farmacéuticos, de diagnóstico, gestión de residuos y la recuperación de la plata. Las proteasas microbianas extracelulares representan una parte importante, más de un tercio de las ventas totales de enzimas industriales en todo el mundo (Cherr y y Fidantsef, 2003) . Aproximadamente el 90% de las proteasas comerciales son enzimas detergentes (Gupta et al., 2002) . La mayoría de las proteasas comerciales, principalmente neutras y alcalinas son producidos por organismos que pertenecen al género Bacillus.

Las serina proteasas de la familia subtilisina o subtilisinas producidas por la especie Bacillus forman el subgrupo más grande de proteasas industriales. Estas enzimas son comercialmente importantes como componentes degradadores de proteínas o aditivos de detergentes para el lavado. Los preparados comerciales de detergente que se utilizan actualmente comprenden las serina proteasas alcalinas de origen natural provenientes de la especie Bacillus o que son preparados de proteasas recombinantes (Maurer, 2004) . Las variantes de las enzimas naturales con mejora de la eficiencia catalítica y/o una mayor estabilidad frente a la temperatura, los agentes oxidantes y el cambio de las condiciones de lavado se han desarrollado por mutagenia dirigida y/o al azar. Ejemplos de proteasas comerciales son por ejemplo subtilisina Carlsberg (Alcalase®, Novozymes, DK) , subtilisina 309 (Savinase®, Novozymes, DK) , subtilisina 147 (Esperase®, Novozymes, DK) , Kannase® (Novozymes, DK) , Purafect® (Genencor Inc., USA) , Purafect Ox®, Properase® (Genencor Inc., USA) y la BLAP de las series S y X (Henkel, DE) .

Se han sido aislado también varias serina proteasas alcalinas (EC 3.4.21) y los genes que codifican estas enzimas a partir de organismos eucariotas, incluyendo levaduras y hongos filamentosos. La patente US nº 3.652.399 y EP 519229 (Takeda Chemical Industries, Ltd., JP) dan a conocer una proteasa alcalina del género Fusarium (estado asexual, teleomorfo) o Gibberella, (estado sexual, anamorfo) en particular procedente de Fusarium sp. S-19-5 (ATCC 20192, IFO 8884) , F.oxysporum f. sp. lini (IFO 5880) o G. saubinetti (ATCC 20193, IFO 6608) , útil en la formulación de detergentes y otras composiciones limpiadoras. Los documentos WO 88/03946 y WO 89/04361 (Novo Industri A/S, DK) dan a conocer un aditivo de detergente enzimático y una composición detergente que comprende una proteasa y una lipasa, en el que la proteasa fúngica procede de Fusarium, específicamente de F. oxysporum y F. solani. Un aditivo para detergente que comprende la proteasa con especificidad para enlaces peptídicos adyacentes para sólo uno o dos aminoácidos específicos se da a conocer en el documento WO 89/06270. El documento WO 1994025583 (NovoNordisk A/S, DK) da a conocer una enzima proteasa activa tripsinoide procedente de una especie Fusarium, en particular una cepa de F. oxysporum (DSM 2672) , y la secuencia de ADN que codifica la misma. La secuencia de aminoácidos de una nueva proteasa procedente de Fusarium sp. BLB (FERM BP-10493) se da a conocer en el documento WO 2006101140 (SODX Co. Ltd, Nakamura) . Además, se han descrito proteasas alcalinas procedentes de especies fúngicas tales como Tritirachium y Conidiobolus (revisado en Anwar y Saleemuddin, 1998) .

La utilización de serina proteasas fúngicas en diferentes aplicaciones también se conoce a partir de varias solicitudes de patente. Por ejemplo, una combinación de una celulasa y una proteasa, en particular, una proteasa tripsinoide de Fusarium sp. DSM 2672 como aditivo o composición detergente se da a conocer en el documento WO 1992018599 (NovoNordisk A/S) . Dichas composiciones detergentes pueden comprender además inhibidores de proteasa reversibles para la estabilización de la (s) enzima (s) como se da a conocer en el documento WO 1992003529 y WO 1992005239 (Novo Nordisk A/S) . El procedimiento para la eliminación o blanqueamiento de la suciedad o manchas de tejidos celulósicos con un híbrido enzimático que comprende una secuencia de aminoácidos catalíticamente activa, dicha proteasa unida a una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio de unión a celulosa se da a conocer en el documento WO 1997028243 (Novo Nordisk A/S) . El documento WO 1997002753 (Novo Nordisk A/S) da a conocer un procedimiento para la limpieza delicada de equipos de proceso sucios utilizando una lipasa y una proteasa que es preferentemente una serina proteasa que puede obtenerse a partir de Fusarium. La utilización de F. equiseti y otros hongos en la reducción de la materia orgánica en las aguas residuales se da a conocer en la solicitud de patente EP 1464626 (Biovitis SA, FR) .

Los retos socioeconómicos y las regulaciones gubernamentales han obligado a la industria de detergentes a tomar

en consideración muchos aspectos ambientales, incluyendo no sólo la utilización de productos químicos más tolerantes que pueden utilizarse en cantidades menores y por lo tanto dejan menos rastros de residuos ambientales, sino también la necesidad de ahorro de energía. Las enzimas detergentes, en particular las proteasas, son ingredientes importantes en composiciones detergentes. La necesidad de ahorrar energía por disminución de las temperaturas de lavado y el mayor uso de fibras sintéticas que no pueden tolerar altas temperaturas y el estilo de vida actual han cambiado los hábitos de los clientes hacia las bajas temperaturas de lavado y ha creado una demanda de nuevas enzimas, que son eficaces a bajas temperaturas.

A pesar del hecho de que se han publicado numerosas publicaciones de patente, revistas y artículos, en los que las serina proteasas de varios microorganismos, por ejemplo, se describen las proteasas alcalinas a baja temperatura de actinomicetos (Nocardiopsis dassonvillei) y microorganismos fúngicos (Paecilomyces marquandii) , por ejemplo, en los documentos EP 0 290 567 y EP 0 290 569 (Novo Nordisk A/S, DK) , existe todavía una gran necesidad de serina proteasas alternativas, que son adecuadas y eficaces en la modificación, degradación y eliminación de materiales proteicos particularmente en intervalos de temperaturas bajas o moderadas y que son estables en presencia de detergentes con propiedades muy variables.

La industria de detergentes está haciendo grandes avances en la adaptación de sus nuevos productos a las costumbres y necesidades de los clientes, a las propiedades de nuevos productos textiles y nuevas lavadoras. Es evidente que el desarrollo de nuevos detergentes, particularmente composiciones para lavandería y lavavajillas, tienen que satisfacerse una amplia gama de diferentes demandas y que cambian rápidamente. Para el cumplimiento de todas las diferentes demandas de la industria de detergentes y de las normas gubernamentales, los nuevos ingredientes de la serina proteasa para composiciones detergentes no sólo deben ser capaces de cumplir con sus tareas en amplios intervalos de pH y temperatura y mantenerse estables en variedad de condiciones, incluyendo intervenciones mecánicas y químicas en combinación con una variedad de diferentes detergentes, también es deseable que la serina proteasa pueda producirse en grandes cantidades, que pueda procesarse de forma rentable corriente abajo, por la fácil separación del caldo de fermentación y los micelios.

Sumario de la invención El objetivo de la presente invención es proporcionar una serina proteasa de origen fúngico que presenta amplia especificidad de sustrato, es activa en amplios intervalos de pH y tiene una amplia temperatura óptima, es decir, funciona tanto a temperaturas bajas como moderadas. Las serina proteasas para detergentes de lavandería y lavavajillas tienen que ser estables también en presencia de detergentes o ser compatibles con detergentes. En particular, el objetivo de la invención es proporcionar una serina proteasa, que es capaz de eliminar material proteico, incluyendo manchas en la colada y la vajilla, a temperaturas más... [Seguir leyendo]

1. Enzima serina proteasa fúngica, caracterizada porque dicha enzima presenta actividad de la serina proteasa y comprende una secuencia de aminoácidos de la enzima Fe_RF6318 madura tal como se define en la SEC. ID. nº:15

o una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 86% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la enzima Fe_RF6318 madura definida en la SEC. ID. nº:15.

2. Enzima serina proteasa fúngica según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha enzima puede obtenerse a partir de Fusarium equiseti. 10

3. Enzima serina proteasa fúngica según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque dicha enzima presenta actividad de la serina proteasa y comprende la secuencia de aminoácidos SEC. ID. nº:15.

4. Enzima serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque una forma 15 madura de dicha enzima presenta un peso molecular entre 20 y 35 kDa.

5. Enzima serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la temperatura óptima de dicha enzima a pH 9 utilizando un tiempo de reacción de 15 min. y la caseína como sustrato es de 30°C a 70°C.

6. Enzima serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque dicha enzima presenta un pH óptimo a 50ºC utilizando un tiempo de reacción de 15 min. y la caseína como sustrato en el intervalo de pH de por lo menos pH 6 a pH 11.

7. Enzima serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque dicha enzima puede degradar y eliminar las manchas proteínicas en presencia de detergente entre 10°C y 60°C.

8. Enzima serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque dicha enzima está codificada por una secuencia polinucleotídica aislada, que se hibrida en condiciones severas con una secuencia polinucleotídica incluida en el plásmido pALK2521 que comprende la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº:9 depositada en Escherichia coli RF7664 con el número de registro DSM 22171.

9. Enzima serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque dicha enzima está codificada por una secuencia polinucleotídica aislada, que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la enzima Fe_RF6318 madura tal como se define en SEC. ID. nº:15 o una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 86% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Fe_RF6318 madura definida en la SEC. ID. nº:15.

10. Enzima serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque dicha enzima está codificada por una molécula de ácido nucleico aislada, que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos caracterizada en la SEC. ID. nº:15.

11. Enzima serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque dicha enzima está codificada por una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia nucleotídica SEC. 45 ID. nº:14.

12. Enzima serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque dicha enzima está codificada por la secuencia polinucleotídica incluida en pALK2529 depositada en Escherichia coli RF7800 con el número de registro DSM 22172.

13. Enzima serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque dicha enzima se produce a partir de un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica una serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 unida operativamente a las secuencias reguladoras que pueden dirigir la expresión del gen que codifica la serina proteasa en un anfitrión 55 adecuado.

14. Enzima serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque dicha enzima se produce en un anfitrión heterólogo.

15. Enzima serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque dicha enzima se produce en un anfitrión microbiano.

16. Enzima serina proteasa fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada porque dicha enzima se produce en un anfitrión del género Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chr y sosporium, 65 Neurospora, Rhizopus, Penicillium y Mortiriella.

17. Enzima serina proteasa fúngica según la reivindicación 16, caracterizada porque dicha enzima se produce en Trichoderma o Aspergillus.

18. Enzima serina proteasa fúngica según la reivindicación 17, caracterizada porque dicha enzima se produce en T. reesei.

19. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica una enzima serina proteasa fúngica seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(a) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que presenta actividad de serina proteasa y que comprende la secuencia de aminoácidos como es representada en la SEC. ID. nº:15;

(b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que presenta actividad de serina proteasa y por lo menos 86% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. nº:15;

(c) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de codificación de la secuencia nucleotídica como es representada en la SEC. ID. nº:10;

(d) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de codificación de la secuencia polinucleotídica contenida en DSM 22171 o DSM 22172;

(e) una molécula de ácido nucleico cuya secuencia de codificación se diferencia de la secuencia de codificación de una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de (c) a (d) debido a la degeneración del código genético; y

(g) una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones severas con una molécula de ácido nucleico contenida en DSM 22171, y que codifica un polipéptido que presenta actividad de serina proteasa y una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 86% de identidad con la secuencia de aminoácidos como es representada en la SEC. ID. nº:15.

20. Vector de expresión recombinante que comprende la secuencia nucleotídica según la reivindicación 19 operativamente unida a las secuencias reguladoras que pueden dirigir la expresión de dicho gen que codifica la serina proteasa en un anfitrión adecuado.

21. Célula anfitriona que comprende el vector de expresión recombinante según la reivindicación 20.

22. Célula anfitriona según la reivindicación 21, caracterizada porque dicho anfitrión es un anfitrión microbiano.

23. Célula anfitriona según la reivindicación 21 o 22, caracterizada porque dicho anfitrión es un hongo filamentoso.

24. Célula anfitriona según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizada porque dicho anfitrión es de un género Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Chr y sosporium, Neurospora, Rhizopus, Penicillium y Mortiriella.

25. Célula anfitriona según la reivindicación 24, caracterizada porque dicho anfitrión es Trichoderma o Aspergillus.

26. Célula anfitriona según la reivindicación 25, caracterizada porque dicho anfitrión es T. reesei.

27. Procedimiento para producir un polipéptido que presenta actividad de serina proteasa, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de cultivar la célula anfitriona según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26 y recuperar el polipéptido.

28. Polipéptido que presenta actividad de serina proteasa codificado por la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 19 y que puede obtenerse por el procedimiento según la reivindicación 27.

29. Procedimiento para la obtención de un preparado enzimático que comprende un polipéptido que presenta actividad de serina proteasa, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de cultivar una célula anfitriona según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26 y, recuperar el polipéptido de las células o separar las células del medio de cultivo y obtener el sobrenadante.

30. Preparado enzimático que puede obtenerse por el procedimiento según la reivindicación 29.

31. Preparado enzimático, que comprende la enzima serina proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a

18.

32. Preparado enzimático según la reivindicación 30 o 31, caracterizado porque dicho preparado comprende otras

enzimas seleccionadas de entre el grupo de proteasa, amilasa, celulasa, lipasa, xilanasa, mananasa, cutinasa, pectinasa u oxidasa con o sin un mediador.

33. Preparado enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, caracterizado porque dicho preparado

comprende un aditivo adecuado seleccionado de entre el grupo de estabilizadores, tampones, tensioactivos, constructores, agentes blanqueadores, mediadores, agentes anticorrosivos, agentes antireprecipitación, cáusticos, abrasivos, abrillantadores ópticos, colorantes, pigmentos y conservantes.

34. Preparado enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, caracterizado porque dicho preparado 10 enzimático está en forma de líquido, polvo o granulado.

35. Utilización de la enzima serina proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o del preparado enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34 para detergentes, para el tratamiento de fibras, para el tratamiento de lana, para el tratamiento del cabello, para el tratamiento del cuero, para el tratamiento de alimentos o piensos, o para cualquiera de las aplicaciones que implican la modificación, degradación o eliminación de material proteínico.

36. Utilización de la enzima serina proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o del preparado enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34 como aditivo detergente. 20

37. Utilización según la reivindicación 36 en detergentes líquidos.

38. Utilización según la reivindicación 36 en detergentes en polvo.