Una enzima lacasa, caracterizada por que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupoque consiste en la SEQ ID 41 (TaLcc2) o una secuencia que muestra una identidad de al menos el 75 % con laSEQ ID NO:

41 y es la más eficaz en el blanqueado de tela vaquera a la temperatura de aproximadamente 40 a50 ºC.

Enzimas lacasa novedosas y sus usos Campo de la invención La presente invención se refiere a una enzima lacasa novedosa útil en muchas aplicaciones. Esta invención se refiere también a un ácido nucleico que codifica la enzima, un vector, una célula huésped y un procedimiento para producir la enzima, así como a la preparación de enzima que comprende la enzima. Además, esta invención se refiere a un procedimiento para tratar tela vaquera, un procedimiento para eliminar manchas, un procedimiento para tratar fibras naturales o sintéticas o fibras lignocelulósicas, un procedimiento para tratar la lana, un procedimiento para tratar el pelo y un procedimiento para blanquear pulpa y aguas residuales de tintorerías y un procedimiento para decolorar tintes. Esta invención se refiere también a diversos usos y composiciones, que pueden usarse en las aplicaciones mencionadas.

Antecedentes de la invención

Las lacasas (EC. 1.10.3.2 p-bencenodiol:oxígeno oxidorreductasa) pertenecen a una familia de oxidasas multicobre. Las lacasas son enzimas distribuidas ampliamente en vegetales superiores, hongos, algunos insectos y bacterias. 15 Se caracterizan por una especificidad de sustrato baja, por oxidar diversos sustratos, incluidos difenoles, polifenoles, diferentes fenoles sustituidos, diaminas, aminas aromáticas e incluso compuestos inorgánicos como el yodo. Las lacasas oxidan sus sustratos mediante un mecanismo de oxidación de un electrón y usan oxígeno molecular como aceptor de electrones. Entre las lacasas, son variables la secuencia principal, la inducción del mecanismo y las características físico-químicas (p. ej., punto isoeléctrico y contenido en hidratos de carbono) y bioquímicas. No obstante, los sitios de unión de cobre de las lacasas se conservan de forma rigurosa.

Varias proteínas lacasa y genes que codifican estas lacasas se han aislado anteriormente. Por ejemplo el documento WO 01/92498 describe una enzima lacasa fúngica aislada a partir de una cepa de Melanocarpus albomyces, la publicación de patente EP 0765394 B1 (que corresponde a la patente de EE. UU. N.º 5.981.243) describe la clonación de un gen de lacasa a partir de Myceliophthora thermophila y su expresión en Aspergillus y la patente de EE. UU. N.º 5.750.388 describe la clonación de un gen de lacasa a partir de Scytalidium thermophilum y su expresión en Aspergillus.

Chefetz et al. (1998a) describen el aislamiento y la caracterización preliminar de una lacasa a partir de abono de residuos del suelo municipales. El microbio que produce esta lacasa se identificó posteriormente como Chaetomium thermophilum y la enzima se purificó y se caracterizó después (Chefetz et al., 1998b) . La enzima referida tenía un pI 30 de 5, 1. La lacasa era estable durante 1 hora a 70 ºC y tenía semividas de 24 y 12 h a 40 y 50 ºC, respectivamente. La enzima era estable a pH de 5 a 10 y el pH óptimo era de 6. Saito et al. (2003) describen la purificación y la caracterización de una lacasa extracelular de un hongo de la familia Chaetomiaceae. La masa molecular de la enzima era de aproximadamente 73 a 80 kDa y el pI de 3, 5. El pH óptimo para la oxidación de la siringaldazina era de 7, 0 y la temperatura óptima fue de 42 ºC. La lacasa era estable durante hasta 288 h a 4 ºC y se calculó que sus semividas correspondientes a 25 y 40 ºC eran de 150 y 20 h.

El documento EP 1167528 divulga una lacasa de Botr y tis cinerea.

Las lacasas tienen muchas aplicaciones industriales potenciales, tales como la deslignificación de pulpas de madera, procedimientos para tratar fibras que contienen lignina, procedimientos para tratar fibras de madera para funcionalizarlas o pegar las fibras, mejorar la producción de etanol combustible a partir de materias primas renovables, aplicaciones en alimentos (por ejemplo en el horneado o en la clarificación de la cerveza o el vino) , diversos procedimientos curativos biológicos y aplicaciones textiles, tales como el tratamiento de tela vaquera, la eliminación de manchas, el tratamiento de diversas fibras para la industria textil, procedimientos para decolorar tintes y procedimientos para tratar aguas residuales de tintorerías, o su uso en composiciones de tinte capilar, en la limpieza de superficies duras o en formulaciones detergentes.

45 En los últimos años, los fabricantes de tela vaquera se han interesado en un aspecto "lavado a la piedra" o un aspecto desgastado. El lavado a la piedra tradicional con piedras de pumita reduce la resistencia del tejido y sobrecarga los aparatos de lavado. La tendencia en los últimos años ha sido hacia procedimientos enzimáticos de acabado de la tela vaquera. El "aspecto blanqueado" de la tela vaquera se obtiene normalmente por medio de productos químicos blanqueantes, p. ej., el hipoclorito de sodio. Hasta ahora, el blanqueado con hipoclorito ha sido 50 el procedimiento de blanqueado más eficaz para la tela vaquera teñida con añil, ya que pueden obtenerse prácticamente todos los tonos. Sin embargo, el procedimiento con hipoclorito es muy perjudicial para el medio ambiente, es difícil de controlar y daña el tejido fácilmente. También es un procedimiento muy poco práctico o incluso perjudicial para el usuario, no puede usarse para productos que contienen licra y es necesario un tratamiento anticloro con varias etapas de aclarado/lavado. Por tanto, existe una necesidad de desarrollar una alternativa para el 55 hipoclorito de sodio menos perjudicial ecológicamente, en particular, se han estudiado las lacasas para ese fin.

El documento WO 97/25468 describe el uso de lacasas en un procedimiento para proporcionar a la tela vaquera teñida un aspecto desgastado. El procedimiento comprende un tratamiento con celulasa y un tratamiento simultáneo o subsiguiente con una enzima oxidante de fenol, tal como una lacasa, y un agente potenciador, tal como metilsiringato. La lacasa de Myceliophthora thermophila es el ejemplo de lacasas de la publicación de patente.

En la industria textil se han desarrollado nuevos materiales, acabados y tintes en los últimos años. Aunque los nuevos desarrollos tienen muchas propiedades ventajosas, tales como un secado fácil, resistencia a la manchas y al agua o colores brillantes de los materiales textiles, frecuentemente, su desventaja es que tienen que lavarse a temperaturas bajas. Las temperaturas bajas se prefieren también por razones económicas, ya que el uso de temperaturas bajas ahorra energía. Por tanto, existe la necesidad de proporcionar lacasas que funcionen a temperaturas bajas.

A pesar de que se dispone de numerosas publicaciones que describen lacasas de diversos microorganismos, sigue existiendo la necesidad de lacasas novedosas, que funcionen de forma más eficaz y sean más adecuadas para las diversas condiciones de diferentes aplicaciones.

Sumario de la invención

Es un objetivo de la presente invención eliminar al menos algunos de los problemas asociados con la técnica anterior. En particular, es un objetivo de esta invención proporcionar una enzima lacasa novedosa con propiedades variables adecuadas para aplicaciones diferentes.

En el presente documento se divulga que pueden aislarse enzimas lacasa que tienen propiedades novedosas y diversas a partir del mismo género, especie e incluso a partir de la misma cepa. Algunas de las lacasas son particularmente adecuadas para su uso a temperaturas relativamente bajas.

Un objeto de esta invención es una enzima lacasa, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID 41 20 (TaLcc2) o una secuencia que muestra una identidad de al menos el 75 % con la secuencia SEQ ID NO:41.

Más específicamente, la enzima lacasa de esta invención se caracteriza por lo que se expone en la parte de caracterización de la reivindicación 1.

Preferentemente, la enzima puede obtenerse a partir de un microorganismo, más preferentemente a partir de un hongo filamentoso, en particular del género Thielavia, más específicamente a partir de la especie Thielavia arenaria.

Ventajosamente, la enzima puede obtenerse a partir de la cepa CBS 116071 depositada el 2 de septiembre de 2004 en el Centraalbureau voor Schimmelcultures, Upsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, Países Bajos.

La enzima funciona en un amplio intervalo de pH desde pH 3 a 9, preferentemente a pH de 4 a 8, más preferentemente a pH de 4, 5 a 6, 5. La enzima funciona también en un intervalo de temperatura amplio. Por ejemplo, en el tratamiento de tela vaquera la enzima es eficaz a de 30 a 80 ºC, preferentemente a temperaturas de 40 a 60 ºC. La enzima presenta una actividad máxima a temperaturas... [Seguir leyendo]

1. Una enzima lacasa, caracterizada por que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID 41 (TaLcc2) o una secuencia que muestra una identidad de al menos el 75 % con la SEQ ID NO:41 y es la más eficaz en el blanqueado de tela vaquera a la temperatura de aproximadamente 40 a 50 ºC.

2. La enzima lacasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la enzima puede obtenerse a partir de una fuente microbiana.

3. La enzima lacasa de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que la enzima puede obtenerse a partir de un hongo filamentoso.

4. La enzima lacasa de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, en la que la enzima puede obtenerse a partir del género Thielavia.

5. La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la enzima puede obtenerse a partir de la cepa depositada CBS 116071.

6. La enzima lacasa de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en el que la enzima está codificada por pALK1347 depositado en E. coli bajo el número DSM 15486.

7. La enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima funciona a pH de 3 a 9

8. La enzima de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la enzima funciona a pH de 4 a 8.

9. La enzima de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la enzima funciona a pH de 4, 5 a 6, 5.

10. La enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el pH óptimo de la enzima es aproximadamente a pH 5, 5.

11. La enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima es eficaz a temperaturas de 30 a 80 ºC.

12. La enzima de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la enzima es eficaz a temperaturas de 40 a 60 ºC.

13. La enzima de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la enzima es eficaz a temperaturas de 40 a 50 ºC.

14. La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima tiene una eficacia máxima en el blanqueado de tela vaquera aproximadamente a pH 6.

15. La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima es eficaz en la eliminación de manchas.

16. La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima puede decolorar tintes.

17. La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la enzima tiene una eficacia máxima en presencia de uno o más mediadores.

18. La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima carece de la secuencia señal.

19. La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima se produce en un huésped productor heterólogo.

20. La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la lacasa se produce en un huésped microbiano.

21. La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la lacasa se produce en un huésped hongo filamentoso.

22. La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima se produce en un huésped del género Trichoderma o Aspergillus.

23. Una secuencia de ácidos nucleicos, caracterizada por que codifica la enzima como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

24. Un vector, caracterizado por que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación

23.

25. El vector de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la secuencia de ácidos nucleicos se ha enlazado de forma funcional a secuencias de control de la expresión, permitiendo la expresión en células huésped procariotas

o eucariotas.

26. Una célula huésped, caracterizada por que la célula comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 24 o 25 introducido en ella; o caracterizada por que la célula comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 23 introducido en ella y por que la célula es una célula huésped heteróloga.

27. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 26, en la que la célula huésped es una célula huésped microbiana.

28. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 26 o 27, en la que la célula huésped pertenece al género

Trichoderma o Aspergillus.

29. Un procedimiento para la producción de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene actividad lacasa, que comprende las etapas de cultivar la célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 y recuperar el polipéptido.

30. Un polipéptido que tiene actividad lacasa codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 23 o por el vector de acuerdo con la reivindicación 24 o 25 y que puede obtenerse mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29.

31. Un procedimiento para obtener una preparación de enzima que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 30, que comprende las etapas de cultivar una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 y o bien recuperar el polipéptido de las células o bien separar las células del medio de cultivo del huésped y obtener el sobrenadante.

32. Una preparación de enzima que puede obtenerse mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31.

33. Una preparación de enzima, que comprende la enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

34. La preparación de enzima de acuerdo con la reivindicación 32 o 33, en la que la preparación de enzima comprende además un/unos aditivo (s) adecuado (s) seleccionado (s) del grupo que comprende estabilizantes, tampones, mediadores y conservantes.

35. La preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, en la que la preparación de enzima es el medio de cultivo gastado del huésped productor.

36. La preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en la que la preparación de enzima está en forma de líquido, polvo o granulado.

37. Un procedimiento para tratar tela vaquera, que comprende poner en contacto tela vaquera en un medio acuoso con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

38. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 37, en el que el tratamiento se lleva a cabo en presencia de un mediador adecuado.

39. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 37 o 38 en el que el tratamiento se lleva a cabo a la temperatura de 30 a 80 ºC.

40. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 39 en el que el tratamiento se lleva a cabo a la temperatura de 40 a 70ºC.

41. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 39 en el que el tratamiento se lleva a cabo a la temperatura de 40 a 60ºC.

42. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41, en el que el tratamiento se lleva a cabo a un intervalo de pH de 3 a 8, preferentemente a pH de 4 a 7, lo más preferentemente a pH de 4, 5 a 6, 5.

43. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 42, en el que el tratamiento se lleva a cabo a un intervalo de pH de 4 a 7.

44. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 42, en el que el tratamiento se lleva a cabo a un intervalo de pH de 4, 5 a 6, 5.

45. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 44, en el que el tratamiento se lleva a cabo en de 15 minutos a 2 horas, preferentemente en de 30 minutos a 90 minutos, lo más preferentemente en de 30 minutos a 60 minutos.

46. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 45 en el que el tratamiento se lleva a cabo en de 30 minutos a 90 minutos.

47. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 45 en el que el tratamiento se lleva a cabo en de 30 minutos a 60 minutos.

48. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 48, en el que la dosificación de la enzima usada en el tratamiento es de 2 a 500 nkat/g de tejido.

49. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 48, en el que la dosificación de la enzima usada en el tratamiento es de 20 a 200 nkat/g de tejido.

50. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 48, en el que la dosificación de la enzima usada en el tratamiento es de 20 a 100 nkat/g de tejido.

51. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 50, en el que el tratamiento se repite una o más veces.

52. Un procedimiento para la eliminación de manchas, que comprende poner en contacto el material que se quiere tratar con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

53. Un procedimiento para blanquear pulpa, que comprende la etapa de poner en contacto dicha pulpa con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

54. Un procedimiento para tratar fibras naturales o sintéticas, que comprende poner en contacto fibras con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

55. Un procedimiento para tratar fibras lignocelulósicas, que comprende poner en contacto fibras con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

56. Un procedimiento para tratar lana, que comprende poner en contacto lana con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

57. Un procedimiento para tratar pelo, que comprende poner en contacto pelo con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

58. Un procedimiento para tratar aguas residuales de tintorerías, que comprende poner en contacto aguas residuales de tintorerías con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

59. Un procedimiento para decolorar tintes, que comprende poner en contacto tintes o un material que contiene tinte con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

60. Uso de una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 o una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 para tratar tela vaquera, para eliminar manchas, para blanquear pulpa, para tratar fibras, para tratar lana, para tratar pelo, para tratar aguas residuales de tintorerías o para decolorar tintes o un material que contiene tinte.