Celulasas mejoradas.

Una proteína de fusión de celulasa que comprende

una primera secuencia de aminoácidos de un núcleo de celulasa,

que es la celulasa 20 K de Melanocarpus albomyces de SEC ID Nº: 2 o una modificación de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la deleción de Ala en la posición 207, la deleción de Val en la posición 208, la sustitución de Phe209Trp y la inserción de Pro después de la posición 206, y

una segunda secuencia de aminoácidos de un engarce y dominio de unión a celulosa, CBD, que es el engarce y el CBD de la celobiohidralasa I de Trichoderma reesei de SEC ID Nº: 4, o una modificación de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la sustitución de tirosina en la posición 492, posición 31 del CBD, 493, 10 posición 32 del CBD, de la CBHI madura de T. reesei con un aminoácido alifático o aromático, y las deleciones de los aminoácidos 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de T. reesei,

en la que dicha primera secuencia de aminoácidos y dicha segunda secuencia de aminoácidos están conectados por una región de unión que tiene la fórmula:

1Val - 2Gln - 3Ile - 4Pro - 5Ser - 6Ser, o

1Gly - 2Glu - 3Ille - 4Gly - 5Ser

Celulasas mejoradas.

Campo de la invención La presente invencion se refiere a nuevas proteinas de fusion de celulasa, a preparaciones y a composiciones que contienen estas proteinas de fusion de celulasa, a vectores de expresion, a celulas hospedadoras y a metodos para su preparacion y a usos de las celulasas, a preparaciones y composiciones en la industria textil, de detergentes y de pasta y papel.

Antecedentes de la invención La celulosa es un polisacarido lineal de restos de glucosa unidos por enlaces 1-1, 4. En la naturaleza, la celulosa esta normalmente asociada con lignina junto con hemicelulosas, tales como xilanos y glucomananos. Las enzimas celuloliticas hidrolizan celulosa y son producidas por una amplia diversidad de bacterias y hongos. Las celulasas son enzimas importantes desde el punto de vista industrial con un valor comercial anual actual de aproximadamente 190 millones de dolares americanos. En la industria textil, las celulasas se usan en el acabado de tela vaquera para crear un aspecto moderno de lavado a la piedra en ropa de tela vaquera en un proceso de biolavado a la piedra (biostoning) y tambien se usan, por ejemplo, para eliminar pelusa y prevenir la acumulacion de fibra en la superficie de prendas de algodon. En la industria de detergentes las celulasas se usan para realzar los colores y para prevenir el agrisado y la acumulacion de fibra en la superficie del tejido de las prendas (pilling) . Adicionalmente las celulasas se usan en la industria alimentaria y en la fabricacion de piensos animales, y tienen un gran potencial en la industria de la pasta y del papel, por ejemplo, en destintado para eliminar la tinta de las superficies de la fibra y en la mejora del drenaje de la pasta. El amplio espectro de usos industriales de las celulasas ha establecido una necesidad de productos comerciales de celulasa que contienen diferentes componentes de celulasa y que actuan optimamente a diferentes intervalos de pH y temperatura.

El uso practico de las celulasas es complicado por la naturaleza de las celulasas conocidas, que a menudo son mezclas de celulasas que tienen una diversidad de actividades y especificidades por sustratos. Por esta razon, se han realizado esfuerzos para obtener celulasas que solo tengan las actividades deseadas. Las propiedades exclusivas de cada celulasa hacen que algunas sean mas adecuadas para determinados fines que otras. Aunque las enzimas difieren de diversas formas, una de las diferencias mas importantes es el pH optimo. Las celulasas neutras son mas activas en el intervalo de pH de 6-8 y las celulasas alcalinas en el intervalo de pH de 7, 5-10, mientras que las celulasas acidas, con un pH optimo de 4, 5-5, 5, muestran niveles de actividad muy bajos a valores de pH mas elevados. Las celulasas neutras y acidas son especialmente utiles en la industria textil. En el tratamiento de tejidos las celulasas atacan a las cadenas de las moleculas de celulosa que forman las fibras de algodon, afectando de esta manera a las caracteristicas del tejido.

En la industrial textil, el aspecto "lavado a la piedra" o aspecto desgastado ha suscitado interes en los productores de tela vaquera en los ultimos aros. El lavado a la piedra tradicional con piedra pomez reduce la resistencia del tejido y sobrecarga las lavadoras. La tendencia se ha dirigido a procesos de acabado enzimaticos de tela vaquera y las celulasas han reemplazado o se estan utilizando junto con la piedra pomez para dar a los tejidos este aspecto "usado" deseado. El tratamiento enzimatico controlado perjudica menos a las prendas y a las lavadoras y elimina la necesidad de utilizar piedra.

Las celulasas aplicadas en el tratamiento de tela vaquera se dividen normalmente en dos grupos principales: celulasas acidas y neutras. Las celulasas acidas actuan tipicamente en un intervalo de pH de 4, 5 a 5, 5 y las celulasas neutras en un intervalo de pH de 6 a 8. Las celulasas acidas utilizadas en el biolavado a la piedra proceden principalmente de Trichoderma reesei (forma sexual de Hypocrea jecorina) y las celulasas neutras proceden de una variedad de hongos, que incluyen los generos Melanocarpus, Humicola, Thielavia, Myceliophthora, Fusarium, Acremonium y Chr y sosporium (Haakana et al. 2004) . Las enzimas de T. reesei incluyen, por ejemplo, celulasas de glucosido de la familia 5 (endoglucanasa II, EGII) , familia 7 (celobiohidrolasa I, CBHI) y familia 12 (endoglucanasa III, EGIII; Ward et al. 1993) y las celulasas neutras, mas frecuentemente endoglucanasas, de la familia 45 y la familia 7 (Henrissat, 1991; Henrissat y Bairoch, 1993) .

Las celulasas comprenden un dominio/nucleo (CO) catalitico que expresan actividad celulasa. Ademas del dominio catalitico la molecula de celulasa puede comprender uno o mas dominios de union a celulosa (CBO, Cellulose Binding Domain) , denominados tambien dominios/modulos de union a carbohidratos (CBO/CBM) , que pueden estar localizados en el extremo N o en el extremo C del dominio catalitico. Los CBO tienen actividad de union a carbohidratos e intervienen en la union de la celulasa con la celulosa cristalina pero tienen escaso o ningun efecto sobre la actividad hidrolitica celulasa de la enzima en sustratos solubles. Estos dos dominios estan tipicamente conectados mediante una region engarzadora flexible y altamente glucosilada.

Las celulasas que ejercen su accion atacando principalmente a la superficie de la fibra, son especialmente utiles en el lavado a la piedra de la tela vaquera terida con colorante indigo, ya que el colorante se localiza en la superficie de la fibra. Cuando se utilizan para tratar el tejido de algodon, las celulasas neutras generalmente requieren un tiempo de lavado mas prolongado que las celulasas acidas. Sin embargo, las celulasas neutras tienen una accion menos agresiva sobre el algodon que las celulasas acidas, y no afectan a la resistencia del tejido tanto como las celulasas acidas. Las celulasas neutras tienen un perfil de pH mas amplio y por tanto el aumento de pH que se produce durante el biolavado a la piedra tiene escaso efecto sobre la actividad de enzimas celulasas neutras. Sin embargo, dado que los tratamientos con celulasa tambien tienen efectos no deseables, tales como, la produccion de daros a la fibra y la perdida de resistencia, debe buscarse un equilibrio adecuado entre los efectos deseados y no deseados.

El documento W097/14804 describe tres nuevas celulasas neutras procedentes de Melanocarpus, que son especialmente utiles en la industria textil y de detergentes. Especialmente se describe una endoglucanasa de 20 kOa (Cel45A) , una endoglucanasa de 50 kOa (Cel7A) y una celobiohidrolasa de 50 kOa (Cel7B) . En el presente documentos, estas celulasas se denominan "celulasa 20K", "celulasa 50K" y "celulasa B 50K", respectivamente, derivan de Melanocarpus albomyces y presentan buenos efectos de lavado a la piedra.

Oadas las exigencias existentes, especialmente en la industria textil y de detergentes, de celulasas adicionales mejoradas, se ha sugerido que, formando proteinas de fusion, podrian obtenerse mejoras en las celulasas. Ademas, en el documento W097/14804 se sugieren, en lineas generales, construcciones de proteinas de fusion de celulasa 20K, celulasa 50K y celulasa B 50K con, por ejemplo, celulasa, hemicelulasa o manasa de Trichoderma reesei o dominios funcionales de las mismas. Ademas, para crear nuevas propiedades para las celulasas descritas, se sugieren fusiones de las celulasas descritas con dominios, tales como dominios de union a celulosa (CBO) , preferentemente con su engarce. Sin embargo, no se proporcionan ejemplos especificos, ni se describen las nuevas propiedades en cuestion.

Las proteinas de fusion de celulasa tambien se conocen, por ejemplo, del documento W096/29397, que desvela endoglucanasas formadas por una fusion entre endoglucanasas de Myceliophthora thermophila, de Macrophomina phaseolina y de Crinipellis scabella y el CBO/engarce de Humicola insolens. Oichas endoglucanasas, en su forma natural, no tienen un CBO/engarce.

El documento EP 663 950 desvela variantes de celulasa, especialmente variantes de celulasa de 43 kOa de Humicola insolens, en las que la celulasa puede incluir una region engarzadora de otra especie de microorganismo, por ejemplo, para proporcionar propiedades mejoradas, tales como resistencia mejorada a tensioactivos anionicos, a oxidacion o a agentes blanqueantes.

Sin embargo, existe una necesidad continua de celulasas mejoradas que tambien sean menos darinas para la fibra en la industria textil y en otros campos donde se utilizan tradicionalmente celulasas. En particular, existe una necesidad continua de celulasas que sean mas eficaces para mejorar la economia de los procesos.

La presente invencion tiene la intencion de satisfacer esta necesidad.

Breve descripción de la invención Un objeto de la presente... [Seguir leyendo]

1. Una proteina de fusion de celulasa que comprende una primera secuencia de aminoacidos de un nucleo de celulasa, que es la celulasa 20 K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2 o una modificacion de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la delecion de Ala en la posicion 207, la delecion de Val en la posicion 208, la sustitucion de Phe209Trp y la insercion de Pro despues de la posicion 206, y

una segunda secuencia de aminoacidos de un engarce y dominio de union a celulosa, CBO, que es el engarce y el CBO de la celobiohidralasa I de Trichoderma reesei de SEC IO N°: 4, o una modificacion de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la sustitucion de tirosina en la posicion 492, posicion 31 del CBO, 493, posicion 32 del CBO, de la CBHI madura de T. reesei con un aminoacido alifatico o aromatico, y las deleciones de los aminoacidos 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de T. reesei,

en la que dicha primera secuencia de aminoacidos y dicha segunda secuencia de aminoacidos estan conectados por una region de union que tiene la formula:

1Val -2Gln - 3Ile -4Pro - 5Ser -6Ser, o 1Gly -2Glu - 3Ille -4Gly -5Ser.

2. La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 1, en la que dicha primera secuencia de aminoacidos es una modificacion de la SEC IO N°: 2 seleccionada del grupo que consiste en: la delecion de Ala en la posicion 207, la delecion de Val en la posicion 208, la sustitucion de Phe209Trp y la insercion de Pro despues de la posicion 206, y/o dicha segunda secuencia de aminoacidos es una modificacion del engarce y del CBO de la SEC IO N°: 4 seleccionada del grupo que consiste en: la sustitucion de tirosina en la posicion 492, posicion 31 del CBO, 493, posicion 32 del CBO, de la CBHI madura de T. reesei, con un aminoacido alifatico o aromatico, y las deleciones de los aminoacidos 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de T. reesei.

3. La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que en dicha segunda secuencia de aminoacidos, el aminoacido tirosina en la posicion 492, posicion 31 del CBO, y/o 493, posicion 32 del CBO, de la CBHI madura de Trichoderma reesei esta sustituido con alanina y/o con triptofano.

4. La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 3, en la que dicha segunda secuencia de aminoacidos se selecciona de un grupo de SEC IO N°: 45, 46, 47 y 48.

5. La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que en dicha segunda secuencia de aminoacidos los aminoacidos 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de Trichoderma reesei esta delecionada.

6. La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 1, en la que dicha segunda secuencia de aminoacidos se selecciona de un grupo de SEC IO N°: 44, 49 y 50.

7. La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que en dicha primera secuencia de aminoacidos el aminoacido valina en la posicion 208 de la secuencia de celulasa 20K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2 se ha delecionado.

8. La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que en dicha primera secuencia de aminoacidos el aminoacido alanina en la posicion 207 de la secuencia de celulasa 20K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2 se ha delecionado.

9. La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que en dicha primera secuencia de aminoacidos el aminoacido fenilalanina en la posicion 209 de la secuencia de celulasa 20K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2 se ha sustituido con Trp.

10. La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que dicha primera secuencia de aminoacidos contiene una prolina insertada despues de la posicion 206 en la secuencia de celulasa 20K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2.

11. La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que dicha primera secuencia de aminoacidos se selecciona de un grupo de SEC IO N°: 37, 38, 39 y 40.

12. La proteina de fusion de celulasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que una preparacion que contiene dicha proteina de fusion se ha estabilizado adicionalmente por tratamiento con calor.

13. Un vector de expresion que comprende una secuencia de polinucleotidos que codifica una primera secuencia de aminoacidos de un nucleo de celulasa, que es la celulasa 20K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2 o una

modificacion de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la delecion de Ala en la posicion 207, la delecion de Val en la posicion 208, la sustitucion de Phe209Trp y la insercion de Pro despues de la posicion 206, y una secuencia de polinucleotidos que codifica una segunda secuencia de aminoacidos de un engarce y un dominio de union a celulosa, CBO, que es el engarce y el CBO de la celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei de SEC IO N°: 4,

o una modificacion de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la sustitucion de tirosina en la posicion 492, posicion 31 del CBO, 493, posicion 32 del CBO, de la CBHI madura de T. reesei, con un aminoacido alifatico o aromatico, y las deleciones de los aminoacidos 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de T. reesei, y una secuencia de polinucleotidos que codifica una region de union que conecta dicha primera y segunda secuencia de aminoacidos, teniendo dicha region de union la formula:

1Val -2Gln - 3Ile -4Pro - 5Ser -6Ser, o 1Gly -2Glu - 3Ille -4Gly -5Ser.

14. El vector de expresion de la reivindicacion 13, en el que la primera secuencia de aminoacidos esta codificada por la SEC IO N°: 1, y la segunda secuencia de aminoacidos esta codificada por la SEC IO N°: 3.

15. El vector de expresion de la reivindicacion 13 o 14, en el que dicha primera secuencia de aminoacidos es una modificacion de la SEC IO N°: 2 seleccionada del grupo que consiste en: la delecion de Ala en la posicion 207, la delecion de Val en la posicion 208, la sustitucion de Phe209Trp y la insercion de Pro despues de la posicion 206, y/o dicha secuencia de aminoacidos es una modificacion del engarce y CBO de SEC IO N°: 4 seleccionada del grupo que consiste en: la sustitucion de tirosina en la posicion 492, posicion 31 del CBO, 493, posicion 32 del CBO de la CBHI madura de T. reesei con un aminoacido alifatico o aromatico y las deleciones 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de T. reesei.

16. El vector de expresion de la reivindicacion 15, que comprende una secuencia de polinucleotidos que codifica dicha segunda secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de SEC IO N°: 45, 46, 47 y 48.

17. El vector de expresion de la reivindicacion 15, que comprende una secuencia de polinucleotidos que codifica dicha segunda secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de SEC IO N°: 49 y 50.

18. El vector de expresion de la reivindicacion 15, que comprende un polinucleotido que codifica dicha primera secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de SEC IO N°: 37, 38, 39 y 40.

19. Una celula hospedadora que comprende un vector de expresion como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18.

20. La celula hospedadora de la reivindicacion 19, que es de origen fungico.

21. La celula hospedadora de la reivindicacion 20, que pertenece a hongos filamentosos.

22. La celula hospedadora de la reivindicacion 20 o 21, que pertenece al genero Trichoderma o Aspergillus.

23. La celula hospedadora de la reivindicacion 22, que es Trichoderma reesei.

24. Un proceso para la produccion de una proteina de fusion de celulasa como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que comprende las etapas de cultivar la celula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 y recuperar la proteina del medio de cultivo.

25. Una preparacion enzimatica que comprende una proteina de fusion de celulasa como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

26. Un proceso de biolavado a la piedra que comprende la etapa de aradir una proteina de fusion de celulasa, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la preparacion de la reivindicacion 25, a tejidos o prendas que contienen algodon.

27. El proceso de la reivindicacion 26, en el que los tejidos o las prendas son de tela vaquera.

28. Un proceso de bioacabado, que comprende la etapa de aradir una proteina de fusion de celulasa, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la preparacion de la reivindicacion 25, a materiales textiles como tejidos o prendas o hilo.

29. El proceso de la reivindicacion 28, en el que los materiales textiles se confeccionan con fibras que contienen celulosa natural o con fibras que contienen celulosa fabricada por el hombre o mezclas de las mismas.

30. El proceso de la reivindicacion 28, en el que los materiales textiles son mezclas de fibras sinteticas y fibras que contienen celulosa.

31. Una composicion de detergente que comprende una proteina de fusion de celulasa, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la preparacion enzimatica de la reivindicacion 25 y auxiliares, tales como

agentes activos en superficie, tensioactivos, agentes blanqueantes o sintetizantes.

32. Un metodo de tratamiento de fibra celulosica que contiene material textil, en el que dicho metodo comprende poner en contacto dicho material textil con la composicion de detergente de la reivindicacion 31.

33. Un metodo para el tratamiento de pasta o fibra derivada de madera, que comprende la etapa de aradir una proteina de fusion de celulasa, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la preparacion de la reivindicacion 25, a pasta quimica o mecanica derivada de madera o a fibra secundaria.

34. Un metodo para mejorar la calidad de piensos para animales, que comprende tratar un material vegetal con una proteina de fusion de celulasa, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la preparacion de la reivindicacion 25.