Proteína de fusión de celulasa que comprende una primera secuencia de aminoácidos de un núcleo de endoglucanasa que tiene al menos una identidad del 75% con la SEQ ID n.

º 2, o un fragmento de la misma que tiene actividad celulasa, y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un conector y un dominio de fijación a la celulosa (CBD) que tiene al menos una identidad del 75% con la SEQ ID n.º 15, o un fragmento de la misma que tiene actividad de fijación a la celulosa.

Proteínas de fusión de celulasas y uso de las mismas.

Campo de la invención La presente invención se refiere a la tecnología enzimática, y más exactamente, a proteínas de fusión de celulasa que comprenden un dominio catalítico y un dominio de fijación a la celulosa. Las proteínas de fusión se pueden producir con técnicas recombinantes mediante el uso de los polinucleótidos, vectores de expresión y células hospedadoras apropiados, que también están englobados por la invención. Las proteínas de fusión y las preparaciones enzimáticas de las mismas son útiles para tratar el material celulósico, tal como el material textil. Además, las proteínas de fusión se pueden utilizar en la industria papelera, en extracción de aceite desde las plantas, en composiciones de detergentes o para mejorar la calidad de los alimentos para consumo animal. Por lo tanto, la invención se refiere además a un procedimiento para tratar material celulósico con la proteína de fusión y, en especial, a los procedimientos para biodesgaste (del inglés biostonning) o bioacabado de tejidos o prendas, especialmente el dril (denim) . La invención también se refiere además a composiciones de detergente y alimento para consumo animal que contienen las proteínas de fusión.

Antecedentes de la invención

La celulosa es el componente estructural más importante de las plantas superiores y se genera en la naturaleza en forma casi pura únicamente en la fibra de algodón. Proporciona una gran resistencia tensora a células vegetales que les ayuda a resistir las agresiones mecánicas y la presión osmótica. La celulosa es un polisacárido lineal de restos de glucosa conectados mediante enlaces β-1, 4. En la naturaleza, la celulosa suele estar asociada a la lignina y a las hemicelulosas. El material celulósico se degrada en la naturaleza mediante una serie de organismos deferentes, entre ellos las bacterias y los hongos. La conversión biológica de la celulosa en glucosa generalmente requiere tres grupos importantes de enzimas: celobiohidrolasas (CBH) , endoglucanasas (EG) y β-glucosidasasas (BG) .

Las celulasas tienen un amplio espectro de aplicaciones industriales. En la industria textil, las celulasas se utilizan en el acabado del dril para crear una apariencia de lavado a la piedra a la moda en las prendas de dril en un proceso de biodesgaste. Las celulasas también se utilizan, por ejemplo, para limpiar de pelusa e impedir la formación de pelotillas en la superficie de las prendas de algodón. En la industria del detergente, las celulasas se utilizan para abrillantar los colores y para impedir el agrisado y la formación de pelotillas en las prendas. Las celulasas se utilizan además en la industria de la alimentación y en la fabricación de alimentos para consumo animal, y tienen un gran potencial en la industria papelera, por ejemplo, en el destintado que libera la tinta de la superficie de las fibras y para mejorar el drenaje de la pasta de papel.

Las celulasas utilizadas industrialmente son a menudo mezclas de enzimas que tienen muy diversas actividades y especificidades de sustrato. Las preparaciones de enzimas comerciales a menudo comprenden tres actividades celulásicas, a saber, CBH, EG y BG. Además, las propiedades únicas de cada celulasa hacen que algunas sean más adecuadas para determinados propósitos que otras y, por lo tanto, también se han hecho esfuerzos para obtener y utilizar celulasas que tienen sólo las actividades deseadas. Las celulasas utilizadas más ampliamente de origen fúngico proceden de Trichoderma reesei. Sin embargo, también se han sugerido otras fuentes fúngicas, p. ej., en la patente de los EE.UU. n.º 5 457 046.

Las celulasas que se aplican al tratamiento del dril se suelen dividir en dos grupos principales: celulasas ácidas y celulasas neutras. Las celulasas ácidas normalmente funcionan a pH de 4, 0 a 5, 5, y las celulasas neutras en el intervalo de pH de 6 a 8. Las celulasas que tienen características tanto del grupo de las ácidas como de las neutras se denominan celulasas híbridas. Las celulasas ácidas utilizadas para el biodesgaste proceden principalmente de Trichoderma reesei (anamorfo de Hypocrea jecorina) y las celulasas neutrales proceden de una variedad de hongos, que incluye los géneros Melanocarpus, Humicola, Myceliophthora, Fusarium, Acremonium y Chr y sosporium (Haakana et al., 2004) . Las enzimas de T. reesei incluyen, p. ej., celulasas de la familia 5 (endoglucanasa II, EGII) , de la familia 7 (celobiohidrolasa I, CBHI) y de la familia 12 (endoglucanasa III, EGIII; Ward et al, 1993) de las glucosilhidrolasas, y las celulosas neutras, más a menudo endoglucanasas, de la familia 45 y de la familia 7 (Henrissat, 1991; Henrissat y Bairoch, 1993, 1996) .

La patente de los EE.UU. n.º 5 874 293 describe una composición mejorada de celulasas que comprende cantidades elevadas de la endoglucanasa EGII de T. reesei para tratar textiles que contienen celulosa. La composición mejoró las propiedades del color, incrementó la luminosidad y la apariencia visual y redujo la tendencia a formar pelotillas. La patente internacional WO 97/14804 describe unas celulasas de 20 kDa y una de 50 kDa con actividad endoglucanasa procedentes de Melanocarpus sp. que son especialmente útiles en la industria textil y de detergentes. Las proteínas de fusión que contienen las proteínas de 20 kDa o de 50 kDa unidas a un dominio de fijación a la celulosa, preferentemente de Trichoderma reesei, es lo que se sugiere que crea las nuevas propiedades enzimáticas. No se ofrecen ejemplos específicos, ni se describen las propiedades deseadas.

Sin embargo, sigue existiendo todavía la necesidad de mejorar las celulasas, entre ellas las endoglucanasas, para que sean más eficaces en el tratamiento de tejidos y en otros ámbitos, en donde tradicionalmente se utilizan las celulasas. En particular, hay una constante necesidad de celulasas más eficaces para mejorar los aspectos económicos del proceso. La presente invención persigue satisfacer estas necesidades.

En la industria textil, el interés de los productores de dril en los últimos años ha sido dar una apariencia de «lavado a la piedra» o una apariencia desgastada. El lavado a la piedra tradicional con piedra pómez reduce la resistencia del tejido y carga las máquinas donde se lava la ropa. Hay una tendencia hacia los procesos de acabado enzimático del dril, y las celulasas han reemplazado a la piedra pómez, o se están utilizado junto a ellas, para dar al tejido el aspecto «ajado» que se desea. Los tratamientos enzimáticos controlados dañan menos las prendas y las máquinas, y eliminan la necesidad de deshacerse de las piedras.

Un problema general asociado al lavado enzimático a la piedra es la retrotinción ocasionada por la redeposición del colorante índigo retirado durante o después del desgaste. La redeposición del colorante índigo reduce el contraste deseado entre los hilos coloreados de índigo y los blancos, y se puede observar más fácilmente por el revés del dril y en los bolsillos interiores (como un incremento del azul) . En el lado del derecho, esto se puede observar como una reducción del contraste entre las áreas coloreadas y las áreas de las cuales se ha retirado el colorante durante el biodesgaste. La retrotinción se puede reducir con el uso durante el tratamiento de agentes de antirretrotinción, tales como alcoholes etoxilados no iónicos, o con la adición de blanqueantes durante las etapas de enjuague. La naturaleza de la enzima afecta a la retrotinción. Las celulasas neutras generalmente retrotiñen menos que las celulasas ácidas.

La patente internacional WO 97/09410 describe la adición de un determinado tipo de celulasa a otra celulasa que tiene actividad de desgaste para reducir la retrotinción. La celulasa adicional pertenece a la familia 5 o a la 7, pero no tiene un efecto de desgaste significativo por sí misma. Preferentemente, dicha celulasa adicional procede de Bacillus o Clostridium.

La patente de los Estados Unidos US 5 916 799 describe composiciones de celulasa que contienen tanto celobiohidrolasas como endoglucanasas que se han sometido a proteólisis limitada para separar el núcleo y los dominios de fijación de las enzimas. Se encontró que las composiciones enzimáticas obtenidas reducían la retrotinción. La patente internacional WO 94/07983 se refiere al hallazgo de que la redeposición del colorante sobre el tejido durante el proceso de lavado a la piedra se puede reducir empleando una composición de celulasas fúngicas, que está sustancialmente libre de componentes de tipo celobiohidrolasa. La patente internacional WO 96/23928... [Seguir leyendo]

1. Proteína de fusión de celulasa que comprende una primera secuencia de aminoácidos de un núcleo de endoglucanasa que tiene al menos una identidad del 75% con la SEQ ID n.º 2, o un fragmento de la misma que tiene actividad celulasa, y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un conector y un dominio de fijación a la celulosa (CBD) que tiene al menos una identidad del 75% con la SEQ ID n.º 15, o un fragmento de la misma que tiene actividad de fijación a la celulosa.

2. Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el núcleo de endoglucanasa tiene al menos el 80% de identidad con la SEQ ID n.º 2, o un fragmento de la misma que tiene actividad celulasa.

3. Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el conector y el CBD tienen al menos el 80% de identidad con la SEQ ID n.º 15, o un fragmento de la misma que tiene actividad de fijación a la celulosa.

4. Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el núcleo de endoglucanasa comprende la secuencia de SEQ ID n.º 2, y el conector y el CBD comprenden la secuencia de SEQ ID n.º 15.

5. Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n.º 4, o un fragmento de la misma que tiene actividad celulasa y actividad de fijación a la celulosa.

6. Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el núcleo de endoglucanasa está codificado por un gen similar al incluido en E. coli DSM 17326, o cuya proteína de fusión está codificada por una fusión génica similar a la incluida en E. coli DSM 18159.

7. Polinucleótido aislado seleccionado entre el grupo que consiste en:

a) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID n.º 3, o una secuencia que codifica una proteína de fusión de celulasa de acuerdo con la reivindicación 1, b) una hebra complementaria de a) .

8. Vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Célula hospedadora que comprende el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Método para producir una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende las etapas de transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que codifica dicha proteína de fusión y cultivar dicha célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína de fusión y, opcionalmente, recuperar y purificar la proteína de fusión producida.

11. Preparación enzimática, que comprende la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

12. Procedmiento para tratar material celulósico, en donde dicho procedimiento comprende poner en contacto el material celulósico con la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o con la preparación enzimática de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el material celulósico es material textil, plantas utilizadas en alimentos para consumo animal, o pasta de papel o fibra secundaria procedente de madera.

14. Alimento para consumo animal, que comprende la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

15. Cepa de Escherichia coli que tiene el número de acceso DSM 18159.

Figura 1

prom cbh1 term cbh1

Figura 2 (A)

3, 5 4, 0 4, 5 5, 0 5, 5 6, 0 6, 5 7, 0 7, 5 8, 0 8, 5

Figura 2 (B)

Figura 4

Figura 6

Figura 8