Procedimiento de ADN recombinante para la obtención en un huésped hongo filamentoso de un nivel de producción más alto de enzima termoestable degradante de xilano de Nonomureae flexuosa Nf xyn11A,

que en su estado de longitud completa original presenta una estructura constituida por un módulo catalítico (CAT) y un módulo de unión a carbohidratos (CMB) separado por una región conectora, caracterizado porque un constructo de ADN, que comprende unas secuencias reguladoras derivadas de hongos filamentosos y una secuencia de ADN acortada codificante de una forma truncada de dicho enzima Nf xyn11A de longitud completa, cuya forma truncada es la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 12 y contiene la región catalíticamente activa de CAT, pero no presenta parte del CBM, se introduce en un huésped hongo filamentoso y se permite que se exprese y secrete dicho enzima Nf xyn11A truncado bajo el control de dichas secuencias reguladoras derivadas de hongo filamentoso, que incluyen una secuencia promotora, una secuencia de señal con o sin una secuencia portadora, y una secuencia de terminador derivada de un hongo filamentoso

Procedimiento y constructos de ADN destinados a incrementar el nivel de producción de enzimas degradantes de carbohidratos en hongos filamentosos.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a la biología molecular, y en particular a procedimientos y constructos de ADN destinados al incremento del nivel de producción en un huésped fúngico filamentoso al producir enzimas degradantes de carbohidratos (CD), que en su estado no modificado nativo presentan un módulo catalítico (CAT) y un módulo de unión a carbohidrato (CBM) separado por una región conectora. Los enzimas degradantes de carbohidratos con la estructura definida anteriormente se encuentran entre hongos filamentosos y bacterias, tales como cepas de actinomicetes, incluyendo Nonomuraea flexuosa Xyn11 o Xyn10A. Para la producción de alto rendimiento, se utiliza una secuencia de ADN acortada, que codifica una forma truncada de los enzimas degradantes de carbohidratos deseados.

Antecedentes de la invención

Las paredes celulares vegetales consisten principalmente de una mezcla compleja de polisacáridos, principalmente celulosa, lignina y hemicelulosa. En la mayor parte del material vegetal, el xilano es el componente hemicelulosa principal, consistente de una cadena principal de residuos beta-D-xilopiranosilo 1,4-ligados que con frecuencia incluyen sustituyentes acetilo, arabinosilo y glucuronosilo. Los enzimas degradantes de carbohidratos resultan útiles como aditivos alimentarios, debido a sus efectos beneficiosos sobre la adsorción de componentes alimentarios y en el preblanqueo de la pulpa kraft, en la que se utilizan como alternativas simples y rentables a los compuestos químicos tóxicos que contienen cloro. El enzima principal necesario para incrementar la deslignificación de la pulpa kraft es la endo-ß-1,4-xilanasa (EC 3.2.1.8), aunque se ha demostrado que la presencia de otros enzimas, tales como mananasa, lipasa y a-galactosidasa, mejoran el efecto del tratamiento enzimático. En el blanqueo con adyuvantes enzimáticos, el pretratamiento con xilanasa elimina el xilano, conservando el contenido de celulosa. De esta manera, se reduce la necesidad de los compuestos químicos blanqueadores y/o se incrementa el brillo del papel. En las aplicaciones alimentarias, los efectos beneficiosos obtenidos tras la adición de enzima, incluyendo una tasa de crecimiento y una eficiencia alimentaria incrementadas, resultan de la reducción de la viscosidad intestinal y la liberación de nutrientes a partir del endosperma del grano y las capas de aleurona.

La utilización de tratamientos enzimáticos tanto en la industria alimentaria como de la pulpa y el papel se ha incrementado drásticamente. A modo de corolario, también se ha incrementado la demanda de enzimas degradantes de carbohidratos. Ello ha animado el desarrollo de nuevos procedimientos eficientes y rentables para la producción de cantidades suficientes de enzimas degradantes de carbohidratos que presenten propiedades adecuadas para la utilización en dichas industrias. Las xilanasas que son activas y estables a temperatura elevada y pH alcalino resultan especialmente deseables en muchos procedimientos industriales, debido a las altas temperaturas y condiciones alcalinas utilizadas en el blanqueo, así como a las altas temperaturas utilizadas en el procesamiento posterior, por ejemplo la peletización.

Es conocido que cepas de actinomicetes producen enzimas termoestables con óptimos alcalinos. Especialmente las cepas de actinomicetes termofílicos son una fuente útil de xilanasas para los procedimientos industriales. Sus actividades y estabilidad a temperatura elevada resultan adecuadas para procedimientos de blanqueo y en otras aplicaciones en las que resulta beneficioso llevar a cabo el tratamiento enzimático a temperaturas elevadas. Se han clonado genes útiles a partir de, por ejemplo, Thermomonospora fusca, Nonomuraea flexuosa DSM43186, anteriormente denominada Actinomadura flexuosa o Microtetraspora flexuosa, así como a partir de algunas especies de Streptomyces. Se ha descrito la clonación de dos xilanasas de Nonomuraea flexuosa en las patentes US nº 5.935.836, nº 6.300.114, nº 6.506.593 y nº 6.667.170.

Los deseados enzimas degradantes de carbohidratos resistentes a altas temperaturas con óptimos de pH extremos se originan de bacterias relativamente no estudiadas. Típicamente, presentan niveles de producción bajos y no resultan adecuados para la producción industrial a gran escala. Exista poca o prácticamente ninguna experiencia sobre la fermentación de dichas bacterias. De acuerdo con lo anterior, la transferencia de un gen originado de dichos microbios, y codificante del enzima deseado, en un organismo huésped heterólogo resulta una alternativa factible para producir el enzima deseado.

Se han producido enzimas bacterianos en huésped bacterianos y levaduras, tal como se da a conocer en, por ejemplo, las patentes US nº 5.306.633 y nº 5.712.142. La patente US nº 5.712.142 describe un procedimiento para incrementar la termoestabilidad de una celulasa bacteriana a partir de Acidothermus cellulyticus mediante corte proteolítico o mediante la expresión de una forma acortada o truncada del gen codificante de la celulasa de tamaño completo en el huésped levadura, Pichia pastoris. El documento WO nº 0196382 A2 describe un procedimiento para incrementar la termoestabilidad de la celulasa de Rhodothermus marinus mediante la expresión de una forma truncada del gen en Escherichia coli. De acuerdo con lo expresado anteriormente, se han descrito varios enzimas bacterianos degradantes de carbohidratos y es conocido cómo mejorar su termoestabilidad.

La truncación de una xilanasa multidominio procedente de la bacteria anaerobia Neocallimastix patriciarum se ha demostrado que mejora la expresión en E. coli, tal como se da a conocer en la patente WO nº 9325693 A1.

Los hongos filamentosos, incluyendo Aspergillus, Trichoderma y Penicillium, es conocido que son productores efectivos de proteínas homólogas y heterólogas. Son claramente los organismos-huésped más preferibles para la producción a gran escala de enzimas industriales, incluyendo la producción en masa de amilasas, glucoamilasas, celulasas, xilanasas, etc. Los primeros intentos de producir enzimas bacterianos en hongos filamentosos fueron desalentadores. Los rendimientos de enzimas bacterianos eran bajos, no superando unas cuantas decenas de miligramos por litro. En muchos de los informes, los enzimas se detectaban únicamente intracelularmente (Jeenes et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 9:327-367, 1991; van den Hondel et al., en: J.W. Bennet y L.L. Lasure (ed.) More genetic manipulations in fungi: Academic Press, San Diego, Calif.).

Se han desarrollado y utilizado estrategias de fusión genética para mejorar los rendimientos de proteínas heterólogas en hongos filamentosos, tal como se da a conocer en las patentes US nº 5.364.770 y WO nº 94/21785, revisados por Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 47:1-11, 1997. La producción de enzimas bacterianos degradantes de carbohidratos a partir de hongos filamentosos utilizando fusiones génicas que comprenden una secuencia de ADN codificante de una proteína (polipéptido) secretable completa o parcial de hongo filamentoso como proteína portadora ha sido descrita en las patentes WO nº 97/27306 y US nº 2003/0148453. Utilizando casetes de expresión dados a conocer en dichas solicitudes de patente y que comprenden secuencias de ADN codificantes de un enzima bacteriano degradante de carbohidratos fusionado en el mismo marco de lectura con una proteína secretable completa o parcial de hongo filamentoso, Paloheimo et al. (Appl. Environ. Microbiol. 69:7073-7082, 2003) han demostrado que los niveles de producción se incrementan notablemente al fusionar el gen codificante del enzima bacteriano en el mismo marco de lectura con un polipéptido secretable de hongo filamentoso que presenta una estructura de dominio intacta.

El objetivo de la presente invención es mejorar adicionalmente los niveles de producción de enzimas degradantes de carbohidratos, particularmente enzimas bacterianos producidos mediante técnicas de ADN recombinante a partir de huéspedes fúngicos filamentosos.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un procedimiento y a constructos de ADN para mejorar los niveles de producción de un enzima degradante de carbohidratos, Nf xyn11A, utilizando técnicas de ADN recombinante y hongos filamentosos como huéspedes.

El enzima degradante de carbohidratos...

1. Procedimiento de ADN recombinante para la obtención en un huésped hongo filamentoso de un nivel de producción más alto de enzima termoestable degradante de xilano de Nonomureae flexuosa Nf xyn11A, que en su estado de longitud completa original presenta una estructura constituida por un módulo catalítico (CAT) y un módulo de unión a carbohidratos (CMB) separado por una región conectora, caracterizado porque un constructo de ADN, que comprende unas secuencias reguladoras derivadas de hongos filamentosos y una secuencia de ADN acortada codificante de una forma truncada de dicho enzima Nf xyn11A de longitud completa, cuya forma truncada es la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 12 y contiene la región catalíticamente activa de CAT, pero no presenta parte del CBM, se introduce en un huésped hongo filamentoso y se permite que se exprese y secrete dicho enzima Nf xyn11A truncado bajo el control de dichas secuencias reguladoras derivadas de hongo filamentoso, que incluyen una secuencia promotora, una secuencia de señal con o sin una secuencia portadora, y una secuencia de terminador derivada de un hongo filamentoso.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las secuencias de ADN codificantes del polipéptido portador se derivan de hongos filamentosos y codifican regiones o dominios seleccionados de un enzima degradante de carbohidratos secretable.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la secuencia de ADN codifica la región nuclear o nuclear/bisagra del polipéptido portador Man5A, o el dominio de unión a carbohidrato (CBD) de Cel6A constituido por una región A, A+B o A+B+B', siendo A un dominio de unión a carbohidrato, siendo B una región bisagra y siendo B' una región bisagra duplicada.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las secuencias de promotor comprenden promotores de Trichoderma o de Aspergillus.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el promotor de Trichoderma es el promotor de cel7A (cbhl).

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el nivel de producción más alto obtenido con dicho constructo de ADN codificante de la forma truncada de dicho enzima Nf xyn11A medido como un incremento de actividad de transformantes de una sola copia es más alto que el nivel de producción obtenido con otro constructo de ADN correspondiente, que es idéntico a dicho constructo de ADN excepto en que comprende una secuencia de ADN codificante del enzima Nf xyn11A de longitud completa correspondiente.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el nivel de producción más alto alcanzado con el constructo de ADN codificante de la forma truncada del enzima Nf xyn11A es por lo menos 2 veces más alto que el nivel de producción alcanzado con otro constructo de ADN correspondiente, que es idéntico a dicho constructo de ADN excepto en que comprende una secuencia de ADN codificante del enzima Nf xyn11A de longitud completa correspondiente.

8. Constructo de ADN para la obtención en un huésped hongo filamentoso de un nivel de producción más alto de enzima termoestable Nf xyn11A degradante de xilano de Nonomuraea flexuosa que presenta en su estado de longitud completa original un módulo catalítico (CAT) y un módulo de unión a carbohidrato (CBM) separado por una región conectora, caracterizado porque dicho constructo de ADN comprende unas secuencias reguladoras derivadas de hongo filamentoso, incluyendo un promotor, una secuencia de señal con o sin una secuencia portadora, y una secuencia de terminador y una secuencia de ADN acortada codificante de una forma truncada de dicho enzima Nf xyn11A de longitud completa, cuya forma truncada es la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 12 y contiene la región catalítica activa de CAT, pero no presenta parte del CBM.

9. Constructo de ADN según la reivindicación 8, en el que las secuencias de ADN codificantes del polipéptido portador son secuencias de ADN derivadas de los mismos o diferentes hongos filamentosos y codifican regiones o dominios seleccionados de un enzima degradante de carbohidratos secretable.

10. Constructo de ADN según la reivindicación 9, en el que la secuencia de ADN codifica la región nuclear o nuclear/bisagra del polipéptido portador, o CBD de Cel6A que consiste en una región A, A+B o A+B+B', siendo A un dominio de unión a carbohidrato, siendo B un dominio bisagra y siendo B' un dominio bisagra duplicado.

11. Constructo de ADN según la reivindicación 8, en el que las secuencias de promotor comprenden promotores de Trichoderma o de Aspergillus.

12. Constructo de ADN según la reivindicación 11, en el que el promotor de Trichoderma es el promotor de cel7A (cbh1).

13. Constructo de ADN según la reivindicación 8, en el que el nivel de producción de dicho constructo de ADN codificante del enzima Nf xyn11A truncado medido como un incremento de actividad a partir del transformante de una sola copia es más alto que el nivel de producción obtenido con otro constructo de ADN correspondiente que es idéntico a dicho constructo de ADN excepto en que comprende una secuencia de ADN codificante del enzima Nf xyn11A de longitud completa correspondiente.

14. Constructo de ADN según la reivindicación 13, en el que el nivel de producción más alto alcanzado con dicho constructo de ADN codificante de la forma truncada del enzima Nf xyn11A es por lo menos dos veces más alto que el nivel de producción alcanzado con otro constructo de ADN correspondiente, que es idéntico a dicho constructo de ADN excepto en que comprende una secuencia de ADN codificante del enzima Nf xyn11A de longitud completa.