Anticuerpos glicomanipulados.

Preparación de anticuerpos que comprende unos anticuerpos modificados de un animal o derivados o fragmentos de los mismos,

que comprende un dominio de unión a inmunoglobulina y una región Fc, específica para un antígeno, caracterizada por que

· los anticuerpos o derivados o fragmentos de los mismos comprenden una estructura de N-glicano sin fucosa ni xilosa seleccionada de entre GlcNAc2Man3, GlcNAc2Man3GlcNAc o GlcNAc2Man3GlcNAc2, y

· por lo menos 90%, preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 99%, todavía más preferentemente por lo menos 100% de los anticuerpos modificados, derivados o fragmentos de los mismos no presenta un residuo lisina C-terminal.

Anticuerpos glicomanipulados.

La invención se refiere al campo de los anticuerpos modificados, derivados o fragmentos de los mismos.

La industria farmacéutica crecientemente requiere sistemas de producción a gran escala alternativos rentables para producir productos biofarmacéuticos. Los sistemas de expresión basados en plantas han demostrado su utilidad como una alternativa adecuada a las fábricas de células animales. Especialmente, sus bajos costes de producción en combinación con una seguridad excepcional debido a los riesgos minimizados de contaminación por la ausencia de patógenos humanos (Raskin I. et ai, Trends Biotechnol. 20:522-531, 2002; Fischer R. et al., Curr. Opin. Plant Biol. 7:152-158, 2004) resultan de importancia vital. Las plantas son capaces de llevar a cabo la mayoría de las modificaciones postraduccionales de los eucariotas superiores (Gomord V. y Faye L., Curr. Opin. Plant Biol. 7:171- 181, 2004). Entre ellas se incluyen glicosilaciones complejas, el procesamiento y plegamiento de las proteínas, así como el ensamblaje de proteínas multiméricas complejas, características que contribuyen a la bioactivídad y a la farmacocinética de los anticuerpos terapéuticos activos. Por lo tanto, se han expresado con éxito diversas proteínas recombinantes, incluyendo anticuerpos humanos, en sistemas de expresión vegetales (HiattA. et al., Nature 342:76- 78, 1989; Ma J.K. etai, Nat. Rev. Genet. 4:794-805, 2003).

Sin embargo, los oligosacáridos ligados a N derivados de plantas difieren considerablemente de los presentes en el ser humano. Aparte de la ausencia general de residuos a1,6-fucosilo en plantas, se ha demostrado que las diferencias en las modificaciones postraduccionales, tales como la glicosilaclón, Influyen sobre las propiedades de las proteínas derivadas de plantas (Daniell et al., supra\ Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109, 1998; Mann et al., Nat. Biotechnol. 21:255-261, 2003). En plantas, los glicanos ligados a N pueden contener residuos (3(1,2)-xllosa (Xyl) antigénicos (Fayet et al., Anal. Biochem. 109:104-108, 1993) y/o alergénlcos (van Ree et al., J. Biol. Chem. 275:11541-11458, 2000) unidos a la mañosa ligada a N del núcleo gllcano y residuos a(1,3)-fucosa (Fue) unidos a GIcNAc proximal que no se encuentran presentes en los glicanos de mamífero. En contraste, los residuos de ácido siálico normalmente no se encuentran unidos a los N-glicanos vegetales. Sin embargo, los anticuerpos vegetales no requieren dichos residuos para una inmunización pasiva tópica exitosa (Ma et al., supra).

El procesamiento mediante glicosilación en el retículo endoplasmátlco (RE) se encuentra conservado en todas las especies y se restringe a los N-glicanos de tipo ollgomanosa (Man5-9GlcNAc2), mientras que el procesamiento generado en el Golgi en glicanos híbridos y de tipo complejo es altamente diverso (Helenius et al., Science 291:2364-2369, 2001). La retención en el RE de las proteínas expresadas en las plantas transgénicas habitualmente mejora los niveles de producción (Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109, 1998; Sharp et al., Biotechnol. Bioen. 73:338-346, 2001). Sin embargo, debido a que el procesamiento de los glicanos puede afectar a la estabilidad de los anticuerpos (Rudd et al., Science 291:2370-2376, 2001), no está claro si un anticuerpo derivado de sistemas de expresión vegetales con estructuras de glicano modificadas se encontraría activo y podría proporcionar una profilaxis sistema efectiva tras la exposición.

Como plataforma de producción compatible a gran escala para proteínas recombinantes en cultivos en suspensión contenidos, el robusto musgo Physcomitrella patens ofrece una tecnología de producción absolutamente libre de componentes animales de última generación mediante la combinación de varios atributos beneficiosos con una tasa extraordinariamente elevada (no sólo entre plantas terrestres) de recombinación homologa de ADN nuclear, permitiendo una inactivación dirigida eficiente de genes (Gorr G. y Wagner S., Modern Biopharmaceuticals 3:919- 929, 2005; Girke T. et al., Plant J. 15:39-48, 1998; Schaefer D.G. y Zyrd J.P., Plant J. 11:1195-1206, 1997). En los intentos de "humanizar" las estructuras oligosacáridas ligadas a N, recientemente se han generado variantes de doble inactivación para los genes de p1,2-xilosiltransferasa y de a1,3-fucosiltransferasa (Axyl-t/Afuc-t) según el documento WO 04/057002. Las variantes del musgo sintetizan glucoproteínas totales que no presentan en absoluto los dos residuos sacáridos específicamente vegetales, y sin embargo no resultaron afectadas en morfología, crecimiento, desarrollo y capacidad de secretar glucoproteínas recombinantes (Koprivova A. et al., Plant Biotechnology J. 2:517-523, 2004; Huether C.M. et al., Plant Biol. 7:292-299, 2005). También se ha demostrado la unión con éxito de galactosa terminal de tipo humano ligada en 1,4, a N-glicanos de musgo (Huether C.M. et al., Plant Biol. 7:292-299, 2005; Gorr y Jost, Bioprocess J. 4:26-30, 2005). Las características funcionales de los anticuerpos, tales como las actividades ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) y CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) no se dan a conocer en dichas referencias.

Aunque se han realizado esfuerzos para producir anticuerpos con sistemas de expresión vegetales, se ha descrito estabilidad de los anticuerpos debido a la modificación de los patrones de glicosilación y efectos negativos sobre la función efectora y la interacción entre regiones Fe y receptores de Fe de estos anticuerpos. Se ha informado de que las funciones mediadas por la parte Fe de las inmunoglobulinas se encuentran fuertemente relacionadas con sus estructuras oligosacáridas ligadas a N (Jefferis R. etal., Immunol. Rev. 163:59-76, 1998).

En particular los oligosacáridos fucosilados nucleares han demostrado una unión más débil al receptor FcyRIII (CD16) expresado sobre las células efectoras y resultan en un potencial lítico reducido (Shields R.L. et al., J. Biol. Chem. 277:26733-26740, 2002; Shinkawa T. et al., J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003). En contraste, los

anticuerpos producidos por levaduras que no presentan fucosa nuclear en su patrón de N-glicanos mostraron un potencial débil en un ensayo de reducción de células B. Sólo las concentraciones elevadas del anticuerpo resultaron en una reducción de las células B de un donante sano. No se dan a conocer en dichas referencias las características de los anticuerpos, tales como las actividades ADCC y CDC.

Sin embargo, tras la producción del anticuerpo in vivo la mayoría de las estructuras de N-glicano presentadas en el presente estudio fueron procesadas in vitro en etapas adicionales mediante la utilización de enzimas específicos para conseguir los patrones de N-glicanos finales (L¡ et al., Nat. Biotechnol., doi: 10.1038/nbt1178, 2006).

La patente US n° 6.602.684 describe procedimientos para incrementar la función efectora de un anticuerpo mediante la modificación de estructuras de glicano complejas, tales como estructuras de glicano N-ligadas bisectadas modificadas por GnTIII.

Los anticuerpos monoclonales contra la rabia se han descrito en el documento WO 2005/000225 A2. Estos anticuerpos son de las clases IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, son producidos en plantas, no presentan estructuras de N- glicano con residuos a-1,3-fucosa y presentan menos epítopos vegetales alergénicos.

El documento WO 2004/050838 A2 describe inmunoglobulinas contra el virus del herpes simplex producido en plantas sin residuos fucosa pero puede comprender xilosa.

La exposición del documento WO 01/31045 A1 se refiere a un procedimiento para producir proteínas con glicoestructuras de tipo mamífero en plantas. Preferentemente las plantas no presentan una fucosiltransferasa o xilosiltransferasa activa.

El documento US 2006/0034829 A1 describe inmunoglobulinas con una estructura de N-glicano de fórmula Man3GlcNAc2.

El documento US 2006/0029604 A1 describe inmunoglobulinas con una estructura de N-glicano de fórmula GlcNAc2Man3GlcNAc2. Estas estructuras son generadas mediante tratamiento con p-galactosidasa.

El documento WO 01/55434 A1 se refiere a la Inhibición de los enzimas modificadores de carbohidratos en plantas, en particular GBSS y GnTI.

Srlraman et al., Plant Biotechnology Journal 2:279-287, 2004, dan a conocer una comparación entre dos anticuerpos diferentes, en la que uno de los anticuerpos presenta la secuencia KDEL en el extremo C-terminal. El anticuerpo con la secuencia KDEL se glicosiló con oligosacáridos de tipo rico en mañosa.

El documento EP 0 361 902 A se refiere a un procedimiento para la homogeneización de preparaciones dse anticuerpos mediante la eliminación de los aminoácidos C-terminales... [Seguir leyendo]

1. Preparación de anticuerpos que comprende unos anticuerpos modificados de un animal o derivados o fragmentos de los mismos, que comprende un dominio de unión a ¡nmunoglobulina y una región Fe, específica para un antígeno, caracterizada por que

los anticuerpos o derivados o fragmentos de los mismos comprenden una estructura de N-glicano sin fucosa ni xilosa seleccionada de entre GlcNAc2Man3, GlcNAc2Man3GlcNAc o GlcNAc2Man3GlcNAc2, y

por lo menos 90%, preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 99%, todavía más preferentemente por lo menos 100% de los anticuerpos modificados, derivados o fragmentos de los mismos no presenta un residuo lisina C-terminal.

2. Preparación de anticuerpos según la reivindicación 1, caracterizada por que las estructuras de N-glicano de los anticuerpos o derivados o fragmentos de los mismos están asimismo exentas de galactosa.

3. Preparación de anticuerpos según la reivindicación 1 o 2, caracterizada por que la preparación de anticuerpos no modificados presenta la misma afinidad para el antígeno que la preparación de los anticuerpos modificados o derivados o fragmentos de los mismos.

4. Preparación de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que la actividad de ADCC de la preparación resulta por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 15%, más preferentemente por lo menos 20%, menos inhibida en solución de suero al por lo menos 10%, preferentemente al por lo menos 40%, que comprende anticuerpos no específicos del animal, preferentemente un mamífero, que una preparación de anticuerpos no modificados del animal específica para el mismo antígeno.

5. Preparación de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que la función efectora de ADCC se incrementa por lo menos 5 veces, preferentemente por lo menos 10 veces, especialmente preferentemente por lo menos 20 veces, más preferentemente por lo menos 30 veces, todavía más preferentemente por lo menos 40 veces, todavía más preferentemente aún por lo menos 50 veces, en comparación con la preparación de anticuerpos no modificados del animal, preferentemente una específica para el mismo antígeno.

6. Preparación de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que menos de 50%, preferentemente menos de 30%, más preferentemente menos de 10% de los anticuerpos, derivados o fragmentos de los mismos carece de una estructura de N-glicano.

7. Preparación de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por que el animal es un mamífero, preferentemente un ser humano, o un camello o un ratón, o un reptil, preferentemente un cocodrilo y/o los anticuerpos modificados del animal o derivados o fragmentos de los mismos son quiméricos, humanizados o humanos y/o monoclonales.

8. Preparación de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada por que la actividad de ADCC de la preparación resulta por lo menos 20%, preferentemente por lo menos 30%, menos inhibida en la solución de anticuerpos no específicos.

9. Preparación de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada por que la actividad CDC está disminuida por lo menos 10% en comparación con una preparación de anticuerpos no modificados específica para el mismo antígeno.

10. Preparación de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada por que la unión de los anticuerpos modificados, derivados o fragmentos de los mismos a CD16is8f/f resulta por lo menos 10% menos inhibida en una solución de suero al por lo menos 10%, preferentemente al por lo menos 40%, que comprende anticuerpos no específicos del animal, que una preparación de anticuerpos no modificados del animal específica para el mismo antígeno y/o por que la lisis celular de las dianas de los anticuerpos modificados, derivados o fragmentos de los mismos, mediada por las células efectoras de cualquier genotipo CD16i58 resulta por lo menos 10% menos inhibida en una solución de suero al por lo menos 10%, preferentemente al por lo menos 40%, que comprende anticuerpos no específicos del animal, que una preparación de anticuerpos no modificados del animal específica para el mismo antígeno.

11. Preparación de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada por que los anticuerpos modificados son anticuerpos IgG.

12. Preparación a base de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para su utilización como un medicamento.

13. Utilización de una preparación a base de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico para la reducción o la inhibición, respectivamente, del crecimiento de células tumorales en un paciente, preferentemente un humano o un mamífero, o para el tratamiento de un cáncer sólido, preferentemente de origen epitelial, preferida en particular para la

inmunoterapia pasiva, especialmente preferida en la que el anticuerpo o mezcla de anticuerpos es utilizado/a en una dosificación de por lo menos 1 mg/dosis, preferentemente en una dosificación de por lo menos 10 mg/dosis, más preferentemente en una dosificación de por lo menos 50 mg/dosis.

14. Procedimiento para la fabricación de una preparación de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 1 10 a 11, caracterizado por que los anticuerpos, fragmentos o derivados, que comprenden un dominio de unión a

¡nmunoglobulina y una región Fe, están expresados en células vegetales, que son deficientes en actividad de (31,2- xilosiltransferasa y actividad de a1,3-fucos¡ltransferasa, siendo preferentemente además deficientes en actividad de 1,4-galactosiltransferasa, preferida en particular con un ADN que codifica los anticuerpos, fragmentos o derivados utilizado para expresar los anticuerpos, fragmentos o derivados carece del codón para la lisina C-terminal, o en el 15 que se elimina la Usina C-terminal de los anticuerpos, fragmentos o derivados, preferentemente mediante una carboxipeptidasa.