GALACTOSILTRANSFERASA.

Moléculas de ADN, caracterizadas porque comprenden una secuencia según la SEC.

ID. nº 1 con un marco de lectura abierto desde el par de bases 513 al par de bases 2417 o una secuencia según la SEC. ID. nº 24 con un marco de lectura abierto desde del par de bases 321 al par de bases 2387, o presentan por lo menos un 80% de identidad con por lo menos una de las secuencias completas anteriores, o comprenden una secuencia que se degenera a las secuencias anteriores debido al código genético, presentando las secuencias que codifican proteínas vegetales con actividad de ß1,3-galactosiltransferasa (actividad de ß1,3-GalT) o siendo complementarias de ésta.

La presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican gluclosiltransferasas. Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos parciales de los mismos así como a vectores que comprenden estos polinucleótidos para la expresión o la destrucción génica de los mismos, a células hospedadoras recombinantes, tejido u organismos transfectados con los polinucleótidos o partes de los mismos o a ADN procedente de los mismos, así como a las glucoproteínas producidas en estas células hospedadoras, tejido u organismos. Además, la presente invención se refiere a la utilización del producto de expresión del mismo in vitro así como in vivo.

En el pasado, se han producido proteínas heterólogas utilizando una variedad de sistemas celulares transformados, tales como los procedentes de bacterias, hongos, tales como estirpes celulares de levadura, insectos, plantas o mamíferos.

Las proteínas producidas en organismos procarióticos pueden no modificarse después de la traducción de una manera similar a la de las proteínas eucarióticas producidas en sistemas eucarióticos, por ejemplo pueden no glucosilarse con azúcares apropiados en particular restos de aminoácidos, tales como restos (N) de ácido aspártico (N unido por glucosilación). Además, el plegamiento de las proteínas eucarióticas producidas por bacterias puede ser inapropiado debido a, por ejemplo, la incapacidad de la bacteria para formar puentes disulfuro de cisteína. Además, las proteínas recombinantes producidas por bacterias frecuentemente se agregan y se acumulan como cuerpos de inclusión insolubles.

Los sistemas de células eucarióticas son más adecuados para la producción de proteínas glucosiladas encontradas en varios organismos eucarióticos, tales como seres humanos, ya que dichos sistemas celulares pueden efectuar modificaciones después de la traducción, tales como la N-glucosilación de proteínas producidas. Sin embargo, un problema encontrado en los sistemas de células eucarióticas que han sido transformadas con genes heterólogos adecuados para la producción de secuencias de proteínas destinadas para la utilización, por ejemplo, como productos farmacéuticos, consiste en que el modelo de glucosilación de dichas proteínas con frecuencia adquiere un modelo natural, es decir, del sistema de células eucarióticas en el que la proteína se ha producido: se producen proteínas glucosiladas que comprenden modelos no animales de glucosilación y éstas a su vez pueden ser inmunógenas y/o alérgenas si se aplican en animales, incluyendo los seres humanos. En las plantas esta limitación ha sido superada por la eliminación de los restos de azúcar 1,2-xilosa y α-1,3 fucosa específicos para las plantas que en las plantas están generalmente unidos a la estructura nuclear de los N-glucanos (Lerouge et al. 1998 Plant Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon et al. 1998 J. Experimental Bot. 49, 1463-1472). En el caso de Arabidopsis thaliana (Strasser et al. 2004 FEBS Lett. 561, 132-136) y en el caso de la briofita Physcomitrella patens (patente EP1431394; Koprivova et al. 2004 Plant Biotechnol. J. 2, 517-523) se generaron mutantes que presentan modelos de N-glucano que carecen completamente de restos nucleares de α-1,3 fucosa y 1,2-xilosa. Sorprendentemente, a pesar de la modificación del modelo del complejo tipo N-glucanos no se observaron alteraciones o cambios morfológicos en la viabilidad en estos mutantes.

Aparte de la adición de los dos restos específicos de la planta descritos anteriormente las etapas de maduración de la glucoproteína en la ER y en el cis-Golgi son idénticas en los vegetales y en los mamíferos hasta la acción de GlcNAc-transferasa I, GlcNAc-transferasa II y Golgi α-manosidasa (Lerouge et al. 1998 Plant Mol. Biol. 38, 31-48). Además el alargamiento del N-glucano se realiza de manera diferente en los dos reinos. Aunque en los mamíferos los restos terminales de GlcNAc están inmediatamente protegidos por la acción de β1,4-(o raras veces, β1,3-)galactosiltransferasa -con la notable excepción de IgG donde esta etapa se produce sólo parcialmente -el alargamiento en las plantas es exclusivamente por β1,3-galactosilación pero sólo una muy pequeña parte de los glucanos parecen experimentar esta modificación como puede deducirse de la abundancia relativa de varios tipos estructurales. Los restos de galactosa en mamíferos pueden protegerse por el ácido siálico y sólo muy raramente sustituirse por la fucosa. De nuevo, las plantas son diferentes ya que están desprovistas de sialilación y en el caso que un resto terminal de galactosa unido en 1,3 esté acoplado esencialmente siempre fucosilan el penúltimo resto de GlcNAc, formando de este modo un determinante de Lewis a (LeA). Aparentemente, la β1,3-galactosiltransferasa es la enzima de restricción mientras que la mayoría de las células vegetales contienen suficiente actividad de α1,4Fuc-transferasa para asegurar que cada antena que contiene Gal se fucosila. La estructura de LeA es un determinante del grupo sanguíneo humano. Es raro como tal en los adultos sanos pero como sialil-Lewis a (sLeA) se encuentra principalmente en los tejidos malignos tal como en el cáncer de colon.

De todos modos, las glucoproteínas que contienen Lea están raramente aisladas en las plantas y en el caso de Physcomitrella presentan una cantidad de sólo hasta el cinco por ciento de las glucoproteínas totalmente solubles, independientemente de si se aíslan de las plantas naturales o se aíslan de mutantes modificados genéticamente por gluco que carecen de fucosa y xilosa del núcleo (Koprivova et al. 2003 Plant Biol. 5, 582-591; Koprivova et al. 2004 Plant Biotechnol. J. 2, 517-523).

Mientras que algunas investigaciones se realizaron en relación con la α1,4-flucosiltransferasa que está implicada en la generación de estructuras de glucano de tipo Lewis a en las plantas (Joly et al. 2002 J. Experimental Bot. 53, 1429-1436; Bakker et al. FEBS Lett. 507, 307-312) no existe ninguna información disponible con respecto a una β1,3 galactosiltransferasa específica que está implicada en el alargamiento de las estructuras de N-glucano en las plantas.

En eucariotas las β1,3-galactosiltransferasas presentan un amplio espectro de especificidades de aceptor así como distintos modelos de expresión tisular (Hennet 2002 Cell. Mol. Life Sci. 59, 1081-1095; Amado et al. 1998 J. Biol. Chem. 21, 12770-12778). Entre los diferentes miembros de la familia de la β1,3-galactosiltransferasa de seres humanos para la β1,3-galactosiltransferasa 2 se ha demostrado in vitro que esta enzima era activa en la transferencia de los restos de galactosa para las estructuras de N-glucano de tipo complejo que representan GlcNAcβ y ovoalbúmina de huevo como sustratos aceptores (Amado et al. 1998 J. Biol. Chem 21, 12770-12778).

Según la existencia de una familia de β1,3-galactosiltransferasas homólogas en seres humanos los análisis de la base de datos pusieron de manifiesto que en diferentes especies vegetales por ejemplo Arabidopsis thaliana y Oryza sativa existen grandes familias de genes similares de genes de β1,3-galactosiltransferasa. Ninguno de los miembros de estos genes de β1,3-galactosiltransferasa se describe que codifican una enzima que comprenden la capacidad de transferir la galactosa desde la UDP-galactosa a sustratos aceptores con restos terminales de GlcNAc no reductores por ejemplo a restos terminales no reductores del complejo de tipo N-glucanos ni in vitro ni in vivo.

Dunaeva et al.(Eur. J. Biochem. 2001 (268): 5521-5529) describe un despliegue diferenciado del ARN de Arabidopsis thaliana durante las condiciones de estrés en las que se ha identificado una proteína ("LSR5") que tiene una determinada similitud con una β1,3-galactosiltransferasa en seres humanos.

El documento WO 2004/035798 describe genes que son aumentan o disminuyen en plantas transgénicas, en particular en Arabidopsis thaliana.

Decker et al.(Current Opinion in Plant Biology 2004(7):166-170) describe epítopos alérgenos en proteínas vegetales glucosiladas, en particular habida cuenta de los productos α-1,3-fucosiltransferasa y β-1,2-xilosiltransferasa.

Un objetivo de la presente invención consiste en identificar, clonar y secuenciar uno o más genes -incluyendo las secuencias genómicas correspondientes no codificadoras -que codifican β1,3-galactosiltransferasas vegetales, y preparar vectores que comprenden los genes, fragmentos del ADN de los mismos o de un ADN alterado o un ADN procedente de los mismos o del ADN que comprende eliminaciones... [Seguir leyendo]

1. Moléculas de ADN, caracterizadas porque comprenden una secuencia según la SEC. ID. nº 1 con un marco de lectura abierto desde el par de bases 513 al par de bases 2417 o una secuencia según la SEC. ID. nº 24 con un marco de lectura abierto desde del par de bases 321 al par de bases 2387, o presentan por lo menos un 80% de identidad con por lo menos una de las secuencias completas anteriores, o comprenden una secuencia que se degenera a las secuencias anteriores debido al código genético, presentando las secuencias que codifican proteínas vegetales con actividad de β1,3-galactosiltransferasa (actividad de β1,3-GalT) o siendo complementarias de ésta.

2. Molécula de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque codifica una proteína con actividad de GlcNAcβ1,3-galactosiltransferasa, una proteína con actividad con respecto a la transferencia de galactosa desde la UDPgalactosa a restos no reductores de GlcNAc, y/o una proteína con actividad con respecto a la transferencia de galactosa desde la UDP-galactosa a restos no reductores de GlcNAc de estructuras de N-glucano unidos a las proteínas.

3. Molécula de ADN según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque presenta por lo menos un 90% de identidad con una de las secuencias según la SEC. ID. nº 1 o la SEC. ID. nº 24 o está degenerada debido al código genético o es complementaria de ésta.

4. Molécula de ADN según la reivindicación 1 a 3, caracterizada porque está asociada por enlace covalente a una sustancia marcadora detectable.

5. Vector que transcribe un ARN complementario que es complementario al ARNm de la β1,3-galactosiltransferasa codificada por la molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y en el que el ARN complementario contiene de 50 a 200 nucleótidos.

6. Vector de expresión, caracterizado porque comprende una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que está inversamente orientada con respecto al activador.

7. Molécula de ADN que codifica una ribozima, caracterizada porque presenta dos secciones de secuencia, cada una de las cuales presenta un longitud de por lo menos 10 a 15 pares de bases y que son complementarias de las secciones de la secuencia de una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 de modo que dicha ribozima acompleja y corta el ARNm transcrito por una molécula de β1,3-GalT natural.

8. Vector biológicamente funcional, caracterizado porque contiene una molécula de ADN según la reivindicación 7.

9. Procedimiento de clonación de β1,3-galactosiltransferasa, caracterizado porque una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 pero que carece de por lo menos la secuencia que codifica la transmembrana se clona en un vector posteriormente transfectado en una célula hospedadora, un tejido del hospedador o un hospedador con estirpes celulares que se obtienen mediante selección y ampliación de células hospedadoras transfectadas, cuyas estirpes celulares expresan la β1,3-galactosiltransferasa activa.

10. Proteína con actividad de β1,3-galactosiltransferasa y por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEC. ID. nº 19 o nº 26.

11. Vector ADN que contiene una molécula con una secuencia de ácido nucleico según la SEC. ID. nº 3.

12. Procedimiento de preparación de células hospedadoras recombinantes, particularmente de células vegetales o plantas, respectivamente, en el que la producción de β1,3-galactosiltransferasa se suprime o se interrumpe completamente, respectivamente, caracterizado porque

• por lo menos uno de los vectores según las reivindicaciones 6, 8 u 11, o un vector que comprende una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, respectivamente, mediante el cual dicha molécula de ADN comprende una mutación por eliminación, inserción y/o sustitución, se inserta en dicha célula hospedadora o planta, respectivamente; o

• la molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha molécula de ADN comprende una mutación por eliminación, inserción y/o sustitución, se inserta en el genoma de dicha célula hospedadora o planta, respectivamente, en la posición de la secuencia homóloga sin mutar.

13. Plantas o células vegetales recombinantes en las que su producción de β1,3-galactosiltransferasa se suprime o se interrumpe completamente,

• que comprende por lo menos uno de los vectores según la reivindicación 6, 8 u 11, o un vector que comprende

una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, respectivamente, mediante el cual dicha molécula de ADN comprende una mutación por eliminación, inserción y/o sustitución; o

• que comprende la molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha molécula de ADN comprende una mutación por eliminación, inserción y/o sustitución, en el genoma de las células o plantas, respectivamente, en la posición de la secuencia homóloga sin mutar.

14. Molécula de ácido péptido nucleico (APN), caracterizada porque comprende una secuencia de bases complementaria de la secuencia de una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que codifica la β1,3-galactosiltransferasa, o comprende una secuencia de bases correspondiente a la secuencia de una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que codifica la β1,3-galactosiltransferasa.

15. Procedimiento de producción de plantas o células, respectivamente, en particular células vegetales que tienen bloqueada la expresión de β1,3-galactosiltransferasa a nivel de transcripción o traducción, respectivamente, caracterizado porque las moléculas de APN según la reivindicación 14 se insertan en las células.

16. Procedimiento de producción de glucoproteínas recombinantes, caracterizado porque las plantas recombinantes, las células vegetales o los tejidos vegetales, respectivamente, según la reivindicación 13, o las plantas, los tejidos o las células vegetales, respectivamente, en los que se inserta la molécula de APN según la reivindicación 14 y que tienen una expresión bloqueada de la β1,3-galactosiltransferasa a nivel de transcripción o traducción, respectivamente, se transfectan con el gen que codifica la glucoproteína, de tal modo que las glucoproteínas recombinantes se expresen.

17. Procedimiento según la reivindicación 16 caracterizado porque las glucoproteínas recombinantes son glucoproteínas, preferentemente para utilización médica.

18. Procedimiento de producción de glucoproteínas con N-glucanos, que comprende el alargamiento in vitro o in vivo del N-glucano de una glucoproteína con una proteína β1,3-galactosiltransferasa activa según la reivindicación

10.

19. Utilización de un vector según la reivindicación 5 para inhibir la expresión de la β1,3-galactosiltransferasa codificada por las moléculas de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.