UTILIZACIÓN DE CONSTRUCTOS QUE COMPRENDEN MOTIVOS DE SECUENCIAS DE RECOMBINACIÓN PARA LA EXPRESIÓN GÉNICA MEJORADA EN MUSGO.

Un método para amplificar la expresión génica en una célula de planta de musgo,

que comprende 1) proporcionar al menos un primer constructo de ácido nucleico heterólogo que comprende al menos una secuencia nucleotídica heteróloga operablemente enlazada a un promotor, en el que dicho constructo está flanqueado en el extremo 5' del mismo por una primera secuencia de recombinación, y está flanqueado en el extremo 3' del dicho constructo por una segunda secuencia de recombinación en la misma orientación que la primera; 2) proporcionar al menos un segundo constructo de ácido nucleico heterólogo que comprende al menos una secuencia nucleotídica heteróloga operablemente enlazada a un promotor, en el que el dicho constructo está flanqueado en el extremo 5' del mismo por dicha segunda secuencia de recombinación, y está flanqueado en el extremo 3' del dicho constructo por dicha primera secuencia de recombinación en la misma orientación que la segunda; y 3) transformar en la célula de la planta de musgo al menos dicho primer y dicho segundo constructo de ácido nucleico heterólogo

La presente invención se refiere métodos y materiales para mejorar la expresión génica en células eucariotas, particularmente en células vegetales comprendidas en musgos, tales como células del protonema de musgos.

La amplificación génica para mejorar la expresión de proteínas recombinantes en cultivos de células de mamíferos es una estrategia usada generalmente (Herlitschka et al. (1996) Protein Expr. Purif. 8, 358-364; Ringold et al. (1981)

J. Mol. Appl.).

En plantas, la puesta en práctica de estrategias de amplificación génica es problemática debido a sucesos de silenciación que se pueden disparar mediante integraciones de múltiples copias de ADN heterólogo (Asaad et al. (1993) Plant Mol Biol. 22, 1067-1085). Recientemente, para superar estas limitaciones, se han desarrollado estrategias para la amplificación génica en plantas. El elemento genético aps que actúa en cis se aisló de una región espaciadora no transcrita de ADN ribosómico del tabaco. Este elemento espaciador se fusionó a genes informadores de interés y dio como resultado un aumento de los números de copias del gen heterólogo de interés y mayores niveles de expresión de proteínas heterólogas a partir de ellos (Borisjuk et al. (2000) Nature Biotechnol. 18, 13031306).

Klimyuk et al. han descrito una estrategia adicional que implica la expresión de proteínas heterólogas vía corte y empalme en trans (documento WO 02/097080).

Hasta la fecha, se sabe poco sobre la correlación del número de copias y la expresión de genes heterólogos en plantas de musgo transgénicas. El uso de musgos para la producción de proteínas recombinantes es una tecnología bien consolidada (documento EP1206561, Gorr et al. 2001, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 363 Supl.: R 85). Típicamente, en el genoma del tejido de musgo transformado se puede integrar un número cualquiera desde 1 hasta alrededor de 50 copias del plásmido transformante (Schaefer (2002) Annu. Rev. Plant Biol. 53, 477-501). Dependiendo del diseño de los constructos transformantes empleados, se puede producir una recombinación homóloga, esto es, un suceso de integración seleccionado, y/o una recombinación heteróloga, esto es, un suceso de integración aleatorio o no seleccionado. De este modo, el uso para la transformación de secuencias de ADN (es decir, comprendidas por secuencias codificantes o no codificantes) que son homólogas con las secuencias de DNA genómico de un musgo puede dar como resultado uno o más sucesos de recombinación homóloga vía la integración del ADN introducido o transformante en el locus genómico del ADN homólogo. El uso de secuencias de ADN (es decir, comprendidas por secuencias codificantes o no codificantes) para la transformación que carecen de cualquier homología apreciable con una secuencia de ADN genómico de un musgo puede dar como resultado uno o más sucesos de recombinación heteróloga vía la integración en el genoma, de manera al azar, del ADN introducido. El musgo es el único sistema vegetal conocido que presenta una frecuencia elevada recombinación homóloga (Strepp et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4368-4373; Schaefer (2002) Annu. Rev. Plant Biol. 53, 477-501). Este atributo aparentemente único de los musgos se ha usado para la introducción seleccionada de genes. Sin embargo, hasta ahora no se ha descrito la amplificación de la expresión génica aumentando el número de copias de plásmidos de interés a fin de generar mayores niveles de proteína por unidad de masa de tejido de musgo establemente transformado.

Sorprendentemente, se ha encontrado que transformando, típicamente cotransformando, células (protoplastos) de tejido de musgo con al menos dos secuencias de ácidos nucleicos heterólogas que comprenden al menos un conjunto de secuencias de recombinación, se da como resultado un incremento del número de copias integradas de constructos de ácidos nucleicos heterólogos en el tejido regenerado, tales como células comprendidas en el protonema de musgos, lo que a su vez está correlacionado con un incremento de los niveles de expresión proteica.

Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar un método mejorado para la producción de proteínas de interés en células comprendidas en tejido de musgo.

Según la presente invención, se proporciona un método para amplificar la expresión génica en una célula de una planta de musgo, que comprende

1) proporcionar al menos un primer constructo de ácido nucleico heterólogo que comprende al menos una secuencia nucleotídica heteróloga operablemente enlazada a un promotor, en el que dicho constructo está flanqueado en el extremo 5' del mismo por una primera secuencia de recombinación, y está flanqueado en el extremo 3' del dicho constructo por una segunda secuencia de recombinación en la misma orientación que la primera;

2) proporcionar al menos un segundo constructo de ácido nucleico heterólogo que comprende al menos una secuencia nucleotídica heteróloga operablemente enlazada a un promotor, en el que el dicho constructo está flanqueado en el extremo 5' del mismo por dicha segunda secuencia de recombinación, y está flanqueado en el extremo 3' del dicho constructo por dicha primera secuencia de recombinación en la misma orientación que la segunda; y

3) transformar en la célula de la planta de musgo al menos dicho primer y dicho segundo constructo de ácido nucleico heterólogo.

El destinatario experto de este documento apreciará que, una vez los dichos al menos dos constructos heterólogos se transformen en la célula de la planta de musgo, tal como un protoplasto de musgo, por ejemplo un protoplasto de Physcomitrella patens, a la que se le permite regenerarse entonces en protonema de musgo, por ejemplo de Physcomitrella patens, sufrirán una recombinación entre sí muchas veces después. Este proceso, una vez iniciado en la célula de la planta de musgo, incrementa el número de copias de los constructos de ADN transformante integrados de la invención allí.

De este modo, como un aspecto adicional de la invención, se proporciona un protonema de musgo, preferiblemente protonema de Physcomitrella patens, comprendido por células transformadas de forma estable, más preferiblemente cotransformadas con al menos dos constructos complementarios de la invención.

Por último, son medibles incrementos significativos en el nivel de proteína heteróloga de interés procedente del al menos un gen heterólogo de interés por encima y más allá de los niveles de proteína que son medibles en células de protonema de musgo procedentes de constructos transformantes convencionales que carecen de las características de los constructos de la invención. La al menos primera y la al menos segunda secuencias de recombinación forman un conjunto complementario que hace posible que los constructos de la invención se recombinan entre sí. Naturalmente, el destinatario experto de este documento apreciará que se pueden emplear constructos de la invención en los que se puede usar uno o más conjuntos complementarios de secuencias de recombinación, dependiendo de cuántas de las secuencias nucleotídicas de interés iguales o diferentes se pretenden utilizar para la producción proteica, tal como 1, 2, 3, 4, ó 5 o más conjuntos. Preferiblemente, por facilidad de conveniencia, se usa un único conjunto complementario de secuencias de recombinación.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un conjunto de vectores de ácido nucleico adecuados para amplificar la expresión génica en una célula de una planta de musgo, en el que dicho conjunto de vectores de ácido nucleico comprende i) al menos un primer constructo de ácido nucleico heterólogo que comprende al menos una secuencia nucleotídica heteróloga operablemente enlazada a un promotor, en el que el dicho constructo está flanqueado en el extremo 5' del mismo por una primera secuencia de recombinación, y está flanqueado en el extremo 3' del dicho constructo por una segunda secuencia de recombinación en la misma orientación que la primera; y ii) al menos un segundo constructo de ácido nucleico heterólogo que comprende al menos una secuencia nucleotídica heteróloga enlazada operablemente a un promotor, en el que el dicho constructo está flanqueado en el extremo 5' del mismo por dicha segunda secuencia de recombinación, y está flanqueado en el extremo 3' del dicho constructo por dicha primera secuencia de recombinación en la misma orientación que la segunda.

De este modo, los dos constructos comprenden secuencias de recombinación... [Seguir leyendo]

1. Un método para amplificar la expresión génica en una célula de planta de musgo, que comprende

1) proporcionar al menos un primer constructo de ácido nucleico heterólogo que comprende al menos una secuencia nucleotídica heteróloga operablemente enlazada a un promotor, en el que dicho constructo está flanqueado en el extremo 5' del mismo por una primera secuencia de recombinación, y está flanqueado en el extremo 3' del dicho constructo por una segunda secuencia de recombinación en la misma orientación que la primera;

2) proporcionar al menos un segundo constructo de ácido nucleico heterólogo que comprende al menos una secuencia nucleotídica heteróloga operablemente enlazada a un promotor, en el que el dicho constructo está flanqueado en el extremo 5' del mismo por dicha segunda secuencia de recombinación, y está flanqueado en el extremo 3' del dicho constructo por dicha primera secuencia de recombinación en la misma orientación que la segunda; y

3) transformar en la célula de la planta de musgo al menos dicho primer y dicho segundo constructo de ácido nucleico heterólogo.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que el dicho al menos primer constructo y el dicho al menos segundo constructo se cotransforman en un protoplasto de musgo.

3. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el dicho primer constructo y el dicho segundo constructo está comprendido por al menos un conjunto de secuencias de recombinación complementarias.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las secuencias de recombinación derivan o se seleccionan de ADN genómico, ADNc, intrón, una región no codificante o un exón o cualquier combinación de los mismos.

5. Un método según la reivindicación 4, en el que la secuencia de recombinación se selecciona de un intrón o una región no codificante.

6. Un método según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que la longitud de las secuencias de recombinación es de 25 a 1000 nucleótidos de longitud.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que la longitud de las secuencias de recombinación es de 50-650 nucleótidos de longitud.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que la longitud de las secuencias de recombinación es de 100-400 nucleótidos de longitud.

9. Un conjunto de vectores de ácido nucleico adecuado para amplificar la expresión génica en una célula de planta de musgo, en el que dicho conjunto de vectores de ácido nucleico comprende i) al menos un primer constructo de ácido nucleico heterólogo que comprende al menos una secuencia nucleotídica heteróloga operablemente enlazada a un promotor, en el que el dicho constructo está flanqueado en el extremo 5' del mismo por una primera secuencia de recombinación, y está flanqueado en el extremo 3' del dicho constructo por una segunda secuencia de recombinación en la misma orientación que la primera; y ii) al menos un segundo constructo de ácido nucleico heterólogo que comprende al menos una secuencia nucleotídica heteróloga operablemente enlazada a un promotor, en el que el dicho constructo está flanqueado en el extremo 5' del mismo por dicha segunda secuencia de recombinación, y está flanqueado en el extremo 3' del dicho constructo por dicha primera secuencia de recombinación en la misma orientación que la segunda.

10. Un conjunto de vectores de ácido nucleico según la reivindicación 9, en el que los constructos son constructos de ADN lineales.

11. Una célula de musgo transformada con un conjunto de vectores de ácido nucleico como se define en la reivindicación 9 ó 10.

12. Una célula de musgo según la reivindicación 11, que es un protoplasto de musgo o una célula de protonema de musgo.

13. Una célula de musgo según la reivindicación 12, que deriva de Physcomitrella patens.

14. Tejido de protonema de musgo comprendido por células transformadas con un conjunto de vectores de ácido nucleico como se define en la reivindicación 9 ó 10.

15. Uso de células de protonema de musgo transformadas con un conjunto de vectores de ácido nucleico como se

define en la reivindicación 9 ó 10, en la producción de proteína a partir de ellas.

16. Uso según la reivindicación 15 de células de protonema de musgo derivadas o seleccionadas de Physcomitrella patens que son transformadas con un conjunto de vectores de ácido nucleico como se define en la reivindicación 9 ó