Anticuerpos frente a ferroportina y métodos de uso.

Anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de ferroportina tat como se expone en SEQ ID NO:

16,en el que dicho anticuerpo comprende las secuencias de aminoacidos de CDR de SEQ ID NO: 5-10.

Anticuerpos frente a ferroportina y métodos de uso Campo de la invención

La invención se refiere a anticuerpos frente a ferroportina y a usos de los mismos.

Antecedentes

El hierro es un oligoelemento esencial requerido para el crecimiento y desarrollo de todos los organismos vivos. El contenido en hierro en los mamíferos se regula controlando la absorción de hierro, el reciclaje de hierro y la liberación de hierro desde las células en las que se almacena. La liberación de hierro está controlada por ferroportina, una proteína exportadora de hierro principal ubicada en la superficie celular de enterocitos, macrófagos y hepatocitos, las principales células que pueden liberar hierro al plasma. La ferroportina, también conocida como MTP1 o ferroportina-1, es una proteina transmembrana múltiple que media en el flujo de salida de hierro celular (Donovan et al., Nature, 43:776-781, 2; Abboud et al., J. Biol. Chem., 275:1996-19912, 2). La ferroportina se expresa altamente en enterocitos duodenales y macrófagos del sistema reticuloendotelial en donde está implicada en el transporte de hierro de la dieta y el reciclaje de hierro de glóbulos rojos senescentes, respectivamente (Yang et al., J. Biol. Chem., 277:39786-39791,22). La ferroportina se regula de manera negativa mediante la hormona reguladora de hierro hepcidina. Se ha mostrado que la hepcidina se une a ferroportina, dando como resultado la intemalización y degradación de ferroportina (Nemeth et al., Blood, 17:328-333, 26; Nemeth et al., Science, 36:29-293, 24; de Domenico et al., Mol. Biol. Cell., 8:2569-2578, 27). Este mecanismo bloquea la liberación de hierro de macrófagos, hepatocitos y enterocitos (Knutson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 12:1324-1328, 28; Nemeth etal., Blood, 17:328-333, 26; Knutson etal., Blood, 12:4191-4197, 23).

La ferroportina es importante para el flujo de salida de hierro tal como se demuestra en ratones transgénicos: la deleción de ferroportina es letal en embriones mientras que la inactivación de ferroportina por una deficiencia condicional da como resultado un aumento del almacenamiento de hierro en enterocitos, macrófagos y hepatocitos (Donovan et al., Cell. Metab., 1:191-2, 25). Thomas y Oates, Gut, 24;53;44-49, notificaron que un anticuerpo policlonal generado usando una secuencia peptídica de ferroportina de rata con n.° de registro de Genbank AAK77858 (que se predice que se encuentra entre los dominios transmembrana 3 y 4) redujo la captación de hierro celular pero no tuvo efecto sobre la liberación de hierro.

Delaby et al. 25 (Blood vol. 16, n.° 12, págs. 3979-3984) describen la producción de anticuerpo policlonal de conejo anti-Fpn1 de ratón y su uso en inmunotransferencia de tipo Western e ¡nmunofluorescencia.

Thomas et al. 22 (The Journal of Nutrition, vol. 132, n.° 4, págs. 68-687) describen un anticuerpo policlonal de conejo anti-Fpn1 de rata generado contra los aminoácidos 247-264 o Fpn1 de rata (IREG1) conjugado con KLH.

Oates et al. 25 (Pflügers Archive-European Journal of Physiology, vol. 45, n.° 5, págs. 317-325) describen el uso de un anticuerpo policlonal de conejo anti-Fpn1 de rata generado contra un péptido que corresponde a los aminoácidos 247-264 de Fpn1 de rata.

El documento US 7.166.448 describe la expresión de Fpn1 y un método de detección de Fpn1 en una muestra que incluye incubar con un agente que se une a Fpn1 y detectar el agente unido.

Sumario de la invención

La invención proporciona anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unen a ferroportina humana, métodos de producción de tales anticuerpos, métodos de uso de tales anticuerpos para detectar ferroportina, formulaciones farmacéuticas que incluyen tales anticuerpos, métodos de preparación de las formulaciones farmacéuticas y métodos de tratamiento de pacientes con las formulaciones farmacéuticas, incluyendo terapia de combinación con estimuladores de la eritropoyesis y/o quelantes de hierro tal como se describe a continuación. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican para tales anticuerpos, vectores y células huésped recombinantes que comprenden tales ácidos nucleicos, y métodos de producción de tales anticuerpos.

En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal aislado, que se une a un dominio extracelular de ferroportina (SEQ ID NO: 16), con la afinidad deseada. En algunos aspectos, la afinidad kd del anticuerpo por las células que expresan ferroportina es de aproximadamente 1-6 M o menos, o de aproximadamente 1'7 M o menos, o de aproximadamente 1'8 M o menos, o de aproximadamente 1'9 M o menos. En algunos aspectos, el dominio extracelular de ferroportina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 46-6, 116-126, 24-25, 325-342, 394-449, 513-517, 35- 57, 116-124, 332-34, 393-449 y 515-518 de SEQ ID NO: 16 y fragmentos de los mismos de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9,1,11612 aminoácidos de longitud. En algunos aspectos, el anticuerpo inhibe la intemalización y/o degradación de ferroportina. En algunas realizaciones, el anticuerpo inhibe la intemalización o degradación mediada por hepcidina de ferroportina. En un aspecto, el anticuerpo disminuye la concentración de hierro intracelular y/o aumenta la concentración de hierro circulante a una CEso de aproximadamente 1-6 M o menos, o de aproximadamente

1'7 M o menos, o de aproximadamente 1"8 M o menos, o de aproximadamente 1"9 M o menos. En otros aspectos, el anticuerpo presente la propiedad en mamíferos de aumentar el recuento (número) de glóbulos rojos o los niveles de hemoglobina o hematocrito, y/o normalizar el recuento de reticulocitos, el volumen celular medio de reticulocitos y/o el contenido en hemoglobina de reticulocitos.

En diversos aspectos, el anticuerpo se une a un fragmento de ferroportina que comprende al menos cinco, diez, quince o más aminoácidos ubicados dentro de los aminoácidos 393-449 de SEQ ID NO: 16, o un epítopo dentro o de este fragmento. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a un epítopo de ferroportina que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más aminoácidos ubicados dentro de los aminoácidos 439-449 de SEQ ID NO: 16. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a un fragmento de ferroportina que comprende los aminoácidos ANIVPETSPES (aminoácidos 439-449 de SEQ ID NO: 16), o un epítopo dentro o de este fragmento. Los epítopos pueden estar completamente dentro del fragmento, o los epítopos del fragmento pueden comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis aminoácidos dentro del fragmento y uno o más aminoácidos fuera del fragmento. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a un fragmento de ferroportina que comprende los aminoácidos NIVPETSPES (aminoácidos 44-449 de SEQ ID NO: 16), o un epítopo dentro o de este fragmento. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a un fragmento de ferroportina que comprende los aminoácidos IVPETSPESV (aminoácidos 441- 45 de SEQ ID NO: 16), o un epítopo dentro o de este fragmento. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a un fragmento de ferroportina que comprende los aminoácidos VPETSPESVP (aminoácidos 442-451 de SEQ ID NO: 16), o un epítopo dentro o de este fragmento. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a un fragmento de ferroportina que comprende los aminoácidos PETSPESVPI (aminoácidos 443-452 de SEQ ID NO: 16), o un epítopo dentro o de este fragmento. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a un fragmento de ferroportina que comprende los aminoácidos TSPESVPIIS (aminoácidos 445-454 de SEQ ID NO: 16), o un epítopo dentro o de este fragmento. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a un fragmento de ferroportina que comprende los aminoácidos ANIVPETSP (aminoácidos 439-447 de SEQ ID NO: 16), o un epítopo dentro o de este fragmento. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a un fragmento de ferroportina que comprende los aminoácidos IVPETSPES (aminoácidos 441-449 de SEQ ID NO: 16), o un epítopo dentro o de este fragmento. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a un fragmento de ferroportina que comprende los aminoácidos ANIVPETS (aminoácidos 439-446 de SEQ ID NO: 16), o un epítopo dentro o de este fragmento. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a un fragmento de ferroportina que comprende los aminoácidos IVPETSPE (aminoácidos 441-448 de SEQ ID NO: 16), o un epítopo dentro o de este fragmento. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a un fragmento de ferroportina que comprende los aminoácidos IVPETSP (aminoácidos 441-447 de SEQ ID NO: 16), o un epítopo dentro o de este fragmento. En algunos aspectos, el anticuerpo se une a un fragmento de ferroportina que comprende los aminoácidos PETSPES (aminoácidos 443-449 de SEQ ID NO: 16), o un epítopo dentro o de este fragmento. En algunos aspectos,... [Seguir leyendo]

Anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de ferroportina tal como se expone en SEQ ID NO: 16, en el que dicho anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 5-1.

Anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de ferroportina tal como se expone en SEQ ID NO: 16, en el que dicho anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 29-34.

Anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de ferroportina tal como se expone en SEQ ID NO: 16, en el que dicho anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 39-44.

Anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de ferroportina tal como se expone en SEQ ID NO: 16, en el que dicho anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 49-54.

Anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de ferroportina tal como se expone en SEQ ID NO: 16, en el que dicho anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 59-64.

Anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de ferroportina tal como se expone en SEQ ID NO: 16, en el que dicho anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 69-74.

Anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de ferroportina tal como se expone en SEQ ID NO: 16, en el que dicho anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 79-84.

Anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de ferroportina tal como se expone en SEQ ID NO: 16, en el que dicho anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 89-94.

Anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de ferroportina tal como se expone en SEQ ID NO: 16, en el que dicho anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 99-14.

Anticuerpo aislado que se une a un dominio extracelular de ferroportina, en el que dicho anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 19-114.

Anticuerpo monoclonal aislado que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que la cadena pesada comprende los aminoácidos 18-466 de SEQ ID NO: 14 y la cadena ligera comprende los aminoácidos 21-239 de SEQ ID NO: 12.

Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y 4.

Anticuerpo según la reivindicación 2, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y 28.

Anticuerpo según la reivindicación 3, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y 38.

Anticuerpo según la reivindicación 4, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y 48.

Anticuerpo según la reivindicación 5, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 y 58.

Anticuerpo según la reivindicación 6, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 y 68.

Anticuerpo según la reivindicación 7, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 y 78.

Anticuerpo según la reivindicación 8, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 y 88.

Anticuerpo según la reivindicación 9, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 y 98.

Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y 18.

Ácido nucleico que codifica para el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21.

Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 22.

Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 23 o el ácido nucleico según la

26.

27.

28.

29.

31.

32.

33.

reivindicación 22.

Método para producir un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, que comprende

(a) administrar a un mamífero no humano un ácido nucleico que codifica para ferroportina tal como se expone en SEQ ID NO: 16, opcionalmente

(b) administrar a dicho mamífero no humano un ácido nucleico igual o diferente que codifica para ferroportina tal como se expone en SEQ ID NO: 16, opcionalmente

(c) administrar a dicho mamífero no humano una composición que comprende membrana celular que expresa ferroportina, y

(d) obtener células que expresan el anticuerpo a partir de dicho mamífero no humano.

Método de producción de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 2 de manera que el ácido nucleico se exprese para producir el anticuerpo.

Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21 y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Método para detectar la presencia de ferroportina en una muestra que comprende incubar la muestra con al menos uno de los anticuerpos monoclonales según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en condiciones que permiten la unión del anticuerpo monoclonal a ferroportina; y detectar el anticuerpo monoclonal unido o la ferroportina unida.

Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1- 21, para la preparación de un medicamento para tratar a un sujeto que tiene un trastorno de la homeostasis del hierro, en el que el trastorno de la homeostasis del hierro se selecciona del grupo que consiste en anemia, septicemia, anemia de inflamación, anemia de cáncer, anemia Inducida por quimioterapia, anemia inflamatoria crónica, insuficiencia cardiaca congestiva, trastorno renal en fase avanzada, enfermedad renal crónica (estadio I, II, II, IV o V), anemia por deficiencia de hierro, enfermedad de ferroportina, hemocromatosls, diabetes, inflamación, artritis reumatoide, arteriesclerosis, tumores, vasculitis, lupus eritematoso sistémico, hemoglobinopatías y trastornos de los glóbulos rojos.

Cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno de la homeostasis del hierro, en el que el trastorno de la homeostasis del hierro se selecciona del grupo que consiste en anemia, septicemia, anemia de inflamación, anemia de cáncer, anemia inducida por quimioterapia, anemia inflamatoria crónica, insuficiencia cardiaca congestiva, trastorno renal en fase avanzada, enfermedad renal crónica (estadio I, II, II, IV o V), anemia por deficiencia de hierro, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis, diabetes, inflamación, artritis reumatoide, arteriosclerosis, tumores, vasculitis, lupus eritematoso sistémico, hemoglobinopatías y trastornos de los glóbulos rojos.

Método de selección de un régimen de tratamiento para un sujeto que necesita tratamiento que comprende:

(a) examinar in vitro una muestra biológica obtenida a partir de dicho sujeto para determinar una disminución del nivel de hierro circulante;

(b) prescribir a dicho sujeto un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-21.

Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21 y estimulador de la eritropoyesis en cantidades terapéuticamente eficaces para su uso en una terapia de combinación para el tratamiento de un trastorno de la homeostasis del hierro en un sujeto que necesita tal tratamiento, en el que el trastorno de la homeostasis del hierro se selecciona del grupo que consiste en anemia, septicemia, anemia de inflamación, anemia de cáncer, anemia inducida por quimioterapia, anemia inflamatoria crónica, insuficiencia cardiaca congestiva, trastorno renal en fase avanzada, enfermedad renal crónica (estadio I, II, II, IV o V), anemia por deficiencia de hierro, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis, diabetes, inflamación, artritis reumatoide, arteriosclerosis, tumores, vasculitis, lupus eritematoso sistémico, hemoglobinopatías y trastornos de los glóbulos rojos.

Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21 y anticuerpo anti-hepcidina en cantidades terapéuticamente eficaces para su uso en una terapia de combinación para el tratamiento de un trastorno de la homeostasis del hierro en un sujeto que lo necesita, en el que el trastorno de la homeostasis del hierro se selecciona del grupo que consiste en anemia, septicemia, anemia de inflamación, anemia de cáncer, anemia inducida por quimioterapia, anemia inflamatoria crónica, insuficiencia cardiaca congestiva, trastorno renal en fase avanzada, enfermedad renal crónica (estadio I, II, II, IV o V), anemia por deficiencia de hierro, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis, diabetes, inflamación, artritis reumatoide, arteriosclerosis,