Anticuerpos biespecíficos bivalentes.

Anticuerpo biespecífico bivalente, que comprende

a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un primer antígeno,

y

b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo antígeno, en el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro.

Anticuerpos biespecïficos bivalentes La presente invenciïn se refiere a nuevos anticuerpos biespecïficos bivalentes, a su preparaciïn y a su utilizaciïn.

Antecedentes de la invenciïn Las proteïnas manipuladas, tales como los anticuerpos biespecïficos o multiespecïficos capaces de unirse a dos o mïs antïgenos, son conocidas de la tïcnica. Estas proteïnas de uniïn multiespecïficas pueden generarse mediante fusiïn celular, conjugaciïn quïmica o tïcnicas de ADN recombinante.

Recientemente se ha desarrollado una amplia diversidad de formatos de anticuerpo biespecïfico recombinante, por ejemplo anticuerpos biespecïficos tetravalentes mediante la fusiïn de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios de cadena sencilla (ver, por ejemplo, Coloma M.J., Nature Biotech. 25:1233-1234, 2007; documento nï WO 2001/077342, y Morrison S.L., Nature Biotech. 25:1233-1234, 2007) .

Ademïs, se han desarrollado algunos otros formatos nuevos en los que ya no se retiene la estructura nuclear del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) , tales como diacuerpos, triacuerpos o tetracuerpos, minicuerpos, varios formatos de cadena sencilla (scFv, Bis-scFv) , que son capaces de unirse a dos o mïs antïgenos (Holliger P. et al., Nature Biotech. 23:1126-1136, 2005; Fischer N. y Lïger O., Pathobiology 74:3-14, 2007; Shen J. et al., Journal of Immunological Methods 318:65-74, 2007; Wu C. et al., Nature Biotech. 25:1290-1297, 2007) .

La totalidad de dichos formatos utiliza conectores para fusionar el nïcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a una proteïna adicional de uniïn (por ejemplo scFv) o para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv (Fischer N. y Lïger O., Pathobiology 74:3-14, 2007) . Aunque resulta evidente que los conectores presentan ventajas para la manipulaciïn de los anticuerpos biespecïficos, tambiïn pueden provocar problemas en contextos terapïuticos. En efecto, estos pïptidos forïneos podrïan inducir una respuesta inmunolïgica contra el lïnker mismo o contra la uniïn entre la proteïna y el lïnker. Ademïs, la naturaleza flexible de estos pïptidos provoca que presenten una mayor tendencia al corte proteolïtico, potencialmente conduciendo a una pobre estabilidad del anticuerpo, a agregaciïn y a una inmunogenicidad incrementada. Ademïs, puede desearse retener funciones efectoras, tales como, por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , que se encuentran mediadas a travïs de la uniïn de receptores de Fc mediante el mantenimiento de un elevado grado de similitud a anticuerpos naturales.

De esta manera, idealmente el objetivo debe ser el desarrollo de anticuerpos biespecïficos que sean muy similares en la estructura general a los anticuerpos naturales (por ejemplo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) , con diferencias mïnimas respecto a las secuencias humanas.

En un enfoque, se han producido anticuerpos biespecïficos que son muy similares a los anticuerpos naturales, utilizando la tecnologïa del cuadroma (ver Milstein C. y Cuello A.C., Nature 305:537-40, 1983) , basada en la fusiïn somïtica de dos lïneas celulares de hibridoma diferentes que expresan anticuerpos monoclonales murinos con las especificidades deseadas del anticuerpo biespecïfico. Debido al apareamiento aleatorio de las cadenas pesada y ligera de dos anticuerpos diferentes dentro de la lïnea celular de hibridoma (o cuadroma) hïbrido resultante, se generan hasta diez especies diferentes de anticuerpo de entre las que ïnicamente una es el anticuerpo biespecïfico funcional deseado. Debido a la presencia de productos secundarios incorrectamente apareados, y rendimientos de producciïn significativamente reducidos, resultan necesarios procedimientos sofisticados de purificaciïn (ver, por ejemplo, Morrison S.L., Nature Biotech. 25:1233-1234, 2007) . En general, se mantiene el mismo problema de productos secundarios mal apareados en el caso de que se utilicen tïcnicas de expresiïn recombinante.

Un enfoque para evitar el problema de los productos secundarios mal apareados, que se conoce como “botïn en ojal”, pretende forzar el apareamiento de dos cadenas pesadas de anticuerpos diferentes mediante la introducciïn de mutaciones en los dominios CH3 para modificar la interfaz de contacto. En una cadena se sustituyen aminoïcidos voluminosos por aminoïcidos con cadenas laterales cortas, para crear un “ojal”. A la inversa, se introducen aminoïcidos con cadenas laterales grandes en el otro dominio CH3, para crear un “botïn”. Mediante la coexpresiïn de estas dos cadenas pesadas (y dos cadenas ligeras idïnticas, que deben ser las apropiadas para ambas cadenas pesadas) , se han observado altos rendimientos de formaciïn de heterodïmeros (“botïn-ojal”) frente a la formaciïn de homodïmeros (“ojal-ojal” o “botïn-botïn”) (Ridgway J.B., Protein Eng. 9:617-621, 1996, y documento nï WO 1996/027011) . El porcentaje de heterodïmeros podrïa incrementarse adicionalmente mediante el remodelaje de las superficies de interacciïn de los dos dominios CH3 utilizando un enfoque de expresiïn fïgica y la introducciïn de un puente disulfuro para estabilizar los heterodïmeros (Merchant A.M. et al., Nature Biotech. 16:677681, 1998; Atwell S., Ridgway J.B., Wells J.A., Carter P., J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997) . Se describen nuevos enfoques para la tecnologïa de botïn-en-ojal en, por ejemplo, el documento EP nï 1870459A1. Aunque este formato

aparentemente resulta muy atractivo, en la actualidad no se dispone de datos que describan la progresiïn hacia el uso clïnico. Una importante limitaciïn de esta estrategia es que las cadenas ligeras de los dos anticuerpos parentales deben ser idïnticas para evitar el apareamiento incorrecto y la formaciïn de molïculas inactivas. De esta manera, esta tïcnica no resulta apropiada para el desarrollo sencillo de anticuerpos biespecïficos bivalentes recombinantes contra dos antïgenos partiendo de dos anticuerpos contra el primer y segundo antïgenos, debido a que las cadenas pesadas de estos anticuerpos y/o las cadenas ligeras idïnticas deben optimizarse.

Simon T. et al., EMBO Journal 9:1051-1056, 1990, se refiere a mutantes de dominio de anticuerpos monoespecïficos. El documento nï WO 93/06217 da a conocer el acoplamiento de dos fragmentos de anticuerpo monoespecïfico o biespecïfico utilizando un residuo de cisteïna con un tiol libre. El documento nï WO 99/37791 da a conocer la utilizaciïn de la interacciïn CL-CH1 como andamiaje de heterodimerizaciïn para constructos de anticuerpo biespecïfico o multiespecïfico.

Descripciïn resumida de la invenciïn La invenciïn se refiere a un anticuerpo biespecïfico bivalente, que comprende:

a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de uniïn especïfica a un primer antïgeno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de uniïn especïfica a un segundo antïgeno, en el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro.

Una realizaciïn adicional de la invenciïn es un mïtodo para la preparaciïn de un anticuerpo biespecïfico bivalente segïn la invenciïn, que comprende las etapas de:

a) transformar una cïlula huïsped con:

- vectores que comprenden molïculas de ïcidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une especïficamente a un primer antïgeno,

- vectores que comprenden molïculas de ïcidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada

de un anticuerpo de uniïn especïfica a un segundo antïgeno, en el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro,

b) cultivar la cïlula huïsped bajo condiciones que permitan la sïntesis de dicha molïcula de anticuerpo, y

c) recuperar dicha molïcula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.

Una realizaciïn adicional de la invenciïn es una cïlula huïsped que comprende:

- vectores que comprenden molïculas de ïcidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une especïficamente a un primer antïgeno,

-vectores que comprenden molïculas de ïcidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de uniïn especïfica a un segundo antïgeno, en el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro.

Una realizaciïn adicional de la invenciïn es una composiciïn, preferentemente una composiciïn farmacïutica o 45 diagnïstica del anticuerpo segïn la invenciïn.

Una realizaciïn adicional de la invenciïn es una composiciïn farmacïutica que comprende un anticuerpo segïn la invenciïn y por lo menos un excipiente farmacïuticamente... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo biespecïfico bivalente, que comprende a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de uniïn especïfica a un primer antïgeno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de uniïn especïfica a un segundo antïgeno, en el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro.

2. Anticuerpo segïn la reivindicaciïn 1, caracterizado porque el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se reïnen en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 del anticuerpo, en el que se altera dicha interfaz con el fin de estimular la formaciïn del anticuerpo biespecïfico bivalente, en el que la alteraciïn se caracteriza porque:

a) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de manera que dentro de la interfaz original, el dominio CH3 de una cadena pesada que se reïne con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo biespecïfico bivalente, se sustituye un residuo aminoïcido por un residuo aminoïcido con un volumen de cadena lateral mayor, generando de esta manera una protuberancia dentro de la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada que es posicionable en una cavidad dentro de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada, y b) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada, de manera que, dentro de la interfaz original del segundo dominio CH3 que se reïne con la interfaz original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespecïfico bivalente, se sustituye un residuo aminoïcido por un residuo aminoïcido con un volumen de cadena lateral mïs pequeïo, generando de esta manera una cavidad dentro de la interfaz del segundo dominio CH3 dentro de la cual puede posicionarse una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3.

3. Anticuerpo segïn la reivindicaciïn 1, caracterizado porque dicho residuo aminoïcido de volumen de cadena lateral mïs grande se selecciona de entre el grupo que consiste de arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) y triptïfano (W) .

4. Anticuerpo segïn la reivindicaciïn 2 ï 3, caracterizado porque dicho residuo aminoïcido de volumen de cadena lateral mïs pequeïo se selecciona de entre el grupo que consiste de alanina (A) , serina (S) , treonina (T) y valina (V) .

5. Anticuerpo segïn cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque ambos dominios CH3 se alteran adicionalmente mediante la introducciïn de cisteïna (C) como aminoïcido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3.

6. Anticuerpo segïn la reivindicaciïn 1, caracterizado porque: uno de los dominios constantes de cadena pesada CH3 de ambas cadenas pesadas se sustituye por un dominio constante de cadena pesada CH1, y el otro dominio constante de cadena pesada CH3 se sustituye por un dominio constante de cadena ligera CL.

7. Mïtodo para la preparaciïn de un anticuerpo biespecïfico bivalente segïn la reivindicaciïn 1, que comprende las

etapas de: a) transformar una cïlula huïsped con:

- vectores que comprenden molïculas de ïcidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de uniïn especïfica a un primer antïgeno,

- vectores que comprenden molïculas de ïcidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de uniïn especïfica a un segundo antïgeno, en el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro,

b) cultivar la cïlula huïsped bajo condiciones que permitan la sïntesis de dicha molïcula de anticuerpo, y c) recuperar dicha molïcula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.

8. Cïlula huïsped que comprende:

- vectores que comprenden molïculas de ïcidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de uniïn especïfica a un primer antïgeno,

- vectores que comprenden molïculas de ïcidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de uniïn especïfica a un segundo antïgeno, en el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro.

9. Composiciïn del anticuerpo biespecïfico bivalente segïn las reivindicaciones 1 a 6.

10. Composiciïn farmacïutica que comprende un anticuerpo biespecïfico bivalente segïn las reivindicaciones 1 a 6 y por lo menos un excipiente farmacïuticamente aceptable.