Anticuerpos anti hsp70 terapéuticos y diagnósticos.

Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que

i) se une a un epítope localizado extracelularmente de la Hsp70 unida a membrana sobre las células tumorales,

en el que dicho epítope comprende o consta de la secuencia de aminoácidos NLLGRFEL (SEC ID N.º: 1) o TKDNNLLGRFELSG (SEC ID N.º: 2); y

ii) comprende las CDR determinadas según Kabat del anticuerpo monoclonal cmHsp70.1 tal y como lo producía el hibridoma cmHsp70.1, depositado en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania) el 14 de noviembre de 2003, y al que se asignó el número de acceso de la DSM ACC2629, o cmHsp70.2, tal y como lo produce el hibridoma cmHsp70.2, depositado en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) el 14 de noviembre de 2003 y al que se asignó el número de acceso de la DSM ACC2630.

Anticuerpos anti hsp70 terapéuticos y diagnósticos 5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones para la detección, prevención y tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades neoplásicas primarias y metastásicas, incluyendo, pero sin limitaciones, leucemia, sarcomas y carcinomas humanos. Según la presente invención, la práctica de la detección,

prevención y tratamiento de enfermedades infecciosas y cáncer está mediada y/o indicada por la presencia y localización de determinados marcadores tumorales sobre la superficie celular de tejidos o células patológicas. En particular, la presente invención se refiere a anticuerpos y moléculas de unión al antígeno que son capaces de unirse a un epítope de la proteína de choque térmico Hsp70 que se localiza extracelularmente sobre las células tumorales. Adicionalmente, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden dichos anticuerpos y 15 su uso en procedimientos de diagnóstico y que permiten tratar enfermedades relacionadas con la respuesta inmune y de otro tipo, como tumores. La presente invención además se refiere al uso de un anticuerpo capaz de reconocer la proteína Hsp70 unida a membrana o un dominio de unión de la misma para la detección y/o el tratamiento de un tumor o enfermedad infecciosa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Las proteínas de choque térmico (Hsp) son moléculas altamente conservadas que median en la protección frente al daño mortal después de diversos estímulos de estrés en células procariotas y eucariotas. Además, en condiciones fisiológicas ayudan al plegamiento de proteínas no nativas o con plegamiento erróneo y previenen la

agregación durante la proliferación y diferenciación celular (Hartl y Hayer-Hartl, Science 295 (2002), 1852-1858. El grupo de las moléculas carabina o chaperonas mejor caracterizadas pertenecen a la familia de Hsp70. Al igual que otras proteínas de estrés, las Hsp70 son más eficaces si funcionan de acuerdo con cofactores como maquinarias de las moléculas carabinas celulares. Junto con las cochaperonas de dominio J (es decir, Hsp40), mantienen el plegamiento de proteínas y ayudan en la translocación a través de las membrana (Pilón y Schekman, Cell 97 (1999), 30 679-682). Las proteínas de choque térmico (HSP) también pueden ser Inducidas por procesos fisiológicos, como la diferenciación y el desarrollo celular (Llndqulst y Cralg, Annu. Rev. Genet. 22 (1988), 631). Las HSP intracelulares funcionan no solo como chaperones moleculares, sino que también están implicadas en el procesamiento y presentación de antígenos (DeNagel y Pierce, Immunol. Today 13 (1992), 86; Hartl y col., Nature 381 (1996), 571). También se ha demostrado que las HSP con un peso molecular de 70 y 90 kDa funcionan como proteínas 35 transportadoras para péptidos derivados de tumores inmunogénicos que inducen una respuesta inmune mediada por células T frente al cáncer (Tamura y col., Science 278 (1997), 117; Schild y col., Current Opinión in Immunology 11 (1999), 109; Srivastava y col., Immunity 8 (1998), 657). Las células presentadoras de antígeno son clave para la captación mediada por receptor de complejos HSP-péptido (Arnold-Schild y col., J. Immunol. 162 (1999), 3757). Varios grupos han publicado una inusual localización de las HSP en la membrana plasmática de células tumorales 40 (Altmeyer y col., Int. J. Cáncer 69 (1996), 340; Ferrarini y col., Int. J. Cáncer 51 (1992), 613; Plselli y col., J. Biol. Regul. Homeost Agents 9 (1995), 55; Tamura y col., J. Immunol. 151 (1993), 5516). Los Inventores fueron los primeros en demostrar que las células NK también deben considerarse como células efectoras importantes para el reconocimiento de Hsp70 unida a membrana en las células tumorales (Multhoff y col., Blood 86 (1995a), 1374; Multhoff y col., Int. J. Cáncer 61 (1995b), 272; Multhoff y col., J. Immunol. 158 (1997), 4341; Botzler y col., Cáncer 45 Immunol. Immunother. 43 (1996a), 226; Botzler y col., Int. J. Cáncer 65 (1996b), 633). Con respecto a estos hallazgos y debido al hecho de que las células normales no expresan Hsp70 en la membrana plasmática, podría especularse que Hsp70 actúa como una estructura de reconocimiento selectivo del tumor por las células NK. Los estudios de bloqueo con anticuerpos mostraron que Hsp70 es una estructura de reconocimiento importante para células NK que se adhieren de forma transitoria al plástico (Multhoff y col., Blood 86 (1995a), 1374; Multhoff y col., 50 Int. J. Cáncer 61 (1995b), 272; Multhoffy col., J. Immunol. 158 (1997), 4341; Botzlery col., Cell Stress & Chaperones 3 (1998), 6).

[0003] Se ha demostrado recientemente que la proliferación y la actividad citolítica de las células NK frente a las células tumorales que expresan Hsp70 podían estimularse con proteína Hsp70 recombinante pero no con Hsc70 o

DnaK (Multhoff y col., Exp. Hematology 27 (1999), 1627). Como células diana para la actividad citolítica de las células NK se usaron las sublíneas tumorales CX+ y CX- con un patrón de expresión de MHC y moléculas de adhesión idéntico, pero que difieren en cuanto a la capacidad para expresar Hsp70 en la membrana plasmática (Multhoffy col., J. Immunol. 158 (1997), 4341).

[0004] Como se describe anteriormente, la presencia y localización de Hsp70 sobre la superficie celular de tejidos o células enfermas, en particular sobre células tumorales, proporciona un marcador valioso y una diana para la intervención terapéutica. Por tanto, es altamente deseable contar con anticuerpos u otras moléculas de unión que

reconozcan específicamente epítopes extracelulares de Hsp70 en dichos tejidos y células.

[0005] Aunque hay disponibles en el mercado varios anticuerpos dirigidos frente a Hsp70 y se han descrito en la literatura, parece que estos no son capaces y/o son poco fiables a la hora de detectar Hsp70 unida a membrana sobre la superficie de las células. Los inventores probaron la capacidad de un panel de estos anticuerpos para

detectar Hsp70 unida a la membrana plasmática. La mayoría de los anticuerpos probados no eran adecuados para esta tarea (SPA-820, Stressgen; H553220-clon7; BD Pharmingen; clon H5147 BRM-22; Sigma; policlonal 0A500, Dako; clon MS-482 W27, NeoMarkers), mientras que otros proporcionaron resultados conflictivos.

[0006] Los anticuerpos anti-Hsp70 de Affinity Bioreagents (MA3-006 y MA3-009) mostraron especificidades 15 diferentes para lotes diferentes. Algunos lotes eran adecuados para la detección de Hsp70 en la membrana

plasmática hasta un grado determinado (Botzler y col., Cell Stress & Chaperones 3 (1998), 6) aunque los lotes recientes no mostraron reactividad con Hsp70 localizada en la superficie celular de las células tumorales. De forma similar, se ha descrito que el clon C92F3A-5 comercializado por Stressgen Inc. como SPA-810 y por MBL, Japón, como SR-B810 reacciona con Hsp70 localizada en la superficie celular en algunas ocasiones (Barreta y col., Cell. 20 Immunol. 222 (2003), 97-104; Feng y col., Blood 100 (2002), 4108-4115), pero los Inventores no fueron capaces de repetir los resultados publicados. En la publicación de Feng y col., la Hsp70 de la superficie celular se detectaba solo en células apoptóticas, lo que puede ser debido a anticuerpos que entran en células apoptótlcas en degradación cuya membrana celular ya no esta intacta y detectan Hsp70 ¡ntracelular. Los conflictivos resultados de Baretto y col. y de otros investigadores podrían además deberse a diferencias en la calidad de los lotes usados para los 25 respectivos experimentos. Tampoco existen publicaciones sobre la unión a Hsp70 de la superficie celular más allá de la del anticuerpo comercializado por MBL.

[0007] La pérdida o cambio de especificidad de un anticuerpo monoclonal también puede deberse a que la línea celular de hibridoma que produce dicho anticuerpo no se ha derivado de una única línea celular. Una mezcla de dos

o más hibridomas diferente producirá una mezcla de dos o más anticuerpos monoclonales con especificidad diferente. La relación de las células dentro del cultivo y, por tanto, la relación entre los diferentes anticuerpos monoclonales producidos por ellos puede variar durante el cultivo. Además, un hibridoma en particular que produce el anticuerpo con la especificidad deseada podría desaparecer de la mezcla si las otras células de hibridoma presentan una ventaja evolutiva. La mezcla de hibridomas en el cultivo también puede ser resultado de mutaciones 35 en determinadas células que lleven a un cambio en las especificidades de los anticuerpos producidos.

[0008] Por tanto, existen la necesidad de una fuente fiable de anticuerpos antl-Hsp70 capaces de detectar epítopes extracelulares... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que

i) se une a un epítope localizado extracelularmente de la Hsp70 unida a membrana sobre las células tumorales, en el que dicho epítope comprende o consta de la secuencia de aminoácidos NLLGRFEL (SEC ID N.°: 1) o TKDNNLLGRFELSG (SEC ID N.°: 2); y

ii) comprende las CDR determinadas según Kabat del anticuerpo monoclonal cmHsp70.1 tal y como lo producía el 10 hibridoma cmHsp70.1, depositado en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania) el 14 de noviembre de 2003, y al que se asignó el número de acceso de la DSM ACC2629, o cmHsp70.2, tal y como lo produce el hibridoma cmHsp70.2, depositado en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) el 14 de noviembre de 2003 y al que se asignó el número de acceso de la DSM ACC2630.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo monoclonal.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, que es el anticuerpo monoclonal cmHsp70.1 tal y como lo producía el hibridoma cmHsp70.1, depositado en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und

Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania) el 14 de noviembre de 2003, y al que se asignó el número de acceso de la DSM ACC2629, o cmHsp70.2, tal y como lo produce el hibridoma cmHsp70.2, depositado en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) el 14 de noviembre de 2003 y al que se asignó el número de acceso de la DSM ACC2630.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es

capaz de mostrar un efecto inhibidor sobre la actividad cltolítlca de las células NK contra las células tumorales que expresan Hsp70.

5. Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un polinucleótido que codifica la región variable de ambas cadenas de la ¡nmunoglobulina del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped que comprende un polinucleótido de la reivindicación 6 o un vector de la reivindicación 7.

9. Una molécula bi o multifuncional que comprende el dominio de unión de un anticuerpo de una 40 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos un dominio funcional adicional.

10. La molécula bi o multifuncional de la reivindicación 9, en la que dicho dominio funcional adicional es un agente citotóxico o un marcador.

11. Una composición que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la

molécula bi o multifuncional de la reivindicación 9 o 10, el polinucleótido de la reivindicación 6, el vector de la reivindicación 7 o la célula de la reivindicación 8.

12. La composición de la reivindicación 11, en la que dicha composición es 50

a) una composición farmacéutica y además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable o

b) una composición diagnóstica y, opcionalmente, además comprende reactivos convencionalmente usados en procedimientos diagnósticos basados en el sistema inmune o en ácidos nucleicos.

13. Un procedimiento de determinación de un tumor que comprende células de ensayo en una muestra de un paciente con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la molécula bi o multifuncional de la reivindicación 9 o 10, en el que la presencia o aumento de la cantidad de Hsp70 localizado a nivel extracelular es indicativo de tumor.

14. Una molécula bi o multifuncional de la reivindicación 9 o 10 para su uso in vivo para diagnosticar una

célula que expresa un epítope localizado a nivel extracelular de Hsp70 en la superficie celular, en la que dicha célula es una célula tumoral o una célula relacionada con una enfermedad inmune o infecciosa.