Anticuerpos anti-cd79b e inmunoconjugados y métodos de uso.

Anticuerpo anti-CD79b humanizado, que comprende:

(1) el dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO:

208 y el dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 207; o (2) un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 208 y un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207, en el que la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a CD79b humana es sustanciamente la misma o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 veces mayor que la afinidad de un anticuerpo murino o quimérico que comprende una secuencia variable de cadena ligera y cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 14 en su forma bivalente, en el que la afinidad de unión se expresa como un valor Kd, y en el que la afinidad de unión se mide mediante Biacore.

Anticuerpos anti-cd79b e inmunoconjugados y métodos de uso CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a composiciones de material útiles para el tratamiento de un tumor hematopoyético en mamíferos y a la utilización de estas composiciones de materia para el mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los tumores malignos (cáncer) son la segunda causa de muerte en los Estados Unidos, después de las enfermedades del corazón (Boring et al., CA Cancer J Clin., 43:7 [ (1993]) . El cáncer se caracteriza por el incremento en el número de células anormales, o neoplásicas, derivadas de un tejido normal que proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de tejidos adyacentes por estas células tumorales neoplásicas, y la generación de células malignas que finalmente se extienden a través de la sangre o el sistema linfático hasta nódulos linfáticos regionales y hasta puntos distantes a través de un proceso denominado metástasis. En un estado canceroso, una célula prolifera bajo condiciones en las que no crecerían células normales. El cáncer se manifiesta en una gran variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasión y agresividad.

Los cánceres que implican células generadas durante la hematopoyesis, un proceso mediante el cual se generan elementos celulares de la sangre, tales como linfocitos, leucocitos, plaquetas, eritrocitos y células “killers” naturales, se refieren como cánceres hematopoyéticos. Los linfocitos que se pueden encontrar en la sangre y el tejido linfático y que son críticos para la respuesta inmune se clasifican en dos clases principales de linfocitos: linfocitos B (células B) y linfocitos T (células T) , que median en la inmunidad humoral y medida por células, respectivamente.

Las células B maduran en la médula ósea y dejan que la médula exprese un anticuerpo de unión a antígeno en su superficie celular. Cuando una célula B intacta encuentra primero el antígeno para el que su anticuerpo unido a membrana es específico, la célula empieza a dividirse rápidamente y su progenie a diferenciarse en células B de memoria y células efectoras denominadas “células plasmáticas”. Las células B de memoria tienen una esperanza de vida más larga y continúan expresando el anticuerpo unido a membrana con la misma especificidad que la célula parenteral original. Las células plasmáticas no producen el anticuerpo unido a membrana, pero en cambio producen el anticuerpo en una forma que se puede secretar. Los anticuerpos secretados son la molécula efectora principal de la inmunidad humoral.

Las células T maduran en el timo que proporciona un ambiente para la proliferación y diferenciación de células T inmaduras. Durante la maduración de células T, las células T realizan el reajuste de genes que producen el receptor de células T y la selección positiva y negativa que ayuda a determinar el fenotipo de la superficie celular de la célula T madura. Los marcadores característicos de la superficie celular de células T maduras son el complejo CD3:receptor de célula T y uno de sus correceptores, CD4 o CD8.

En los intentos por descubrir dianas celulares eficaces para la terapia contra el cáncer, los investigadores han buscado identificar polipéptidos transmembrana u otros polipéptidos asociados a membranas que se expresan específicamente en la superficie de uno o más tipos particulares de células cancerosas en comparación con una o más células no cancerosas normales. A menudo, dichos polipéptidos asociados a membrana se expresan de manera más abundante en la superficie de las células cancerosas en comparación con la superficie de las células no cancerosas. La identificación de polipéptidos antígenos de la superficie celular asociados a tumores ha proporcionado la capacidad de reconocer específicamente células cancerosas para la destrucción a través de terapias basadas en anticuerpos. En este aspecto, cabe indicar que la terapia basada en anticuerpos se ha demostrado muy eficaz en el tratamiento de ciertos tumores. Por ejemplo, HERCEPTIN® y RITUXAN® (ambas de Genentech Inc, South San Francisco, California) son anticuerpos que se han utilizado satisfactoriamente para tratar el cáncer de mama y el linfoma de no Hodgkin, respectivamente. Más específicamente, HERCEPTIN® es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se une selectivamente al dominio extracelular del protooncogén del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) . Se observa la sobreexpresión de la proteína HER2 en el 25-30% de cánceres de mama primarios. RITUXAN® es un anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico modificado genéticamente dirigido contra el antígeno CD20 hallado en la superficie de linfocitos B normales u malignos. Estos anticuerpos se producen recombinantemente en células CHO.

En otros intentos por descubrir dianas celulares eficaces para la terapia contra el cáncer, los investigadores han buscado identificar (1) polipéptidos no asociados a membrana que son producidos específicamente por uno o más tipos particulares de células cancerosas en comparación a por uno o más tipos particulares de células normales no cancerosas, (2) polipéptidos que son producidos por células cancerosas en un nivel de expresión que es significativamente más elevado que el de una o más células normales no cancerosas, o (3) polipéptidos cuya expresión está limitada específicamente a sólo un tipo de tejido (o a un número muy limitado de diferentes tejidos) tanto en estado canceroso como no canceroso (por ejemplo, tejido de próstata normal y de tumor de próstata) .

Dichos polipéptidos pueden permanecer localizadas intracelularmente o se puede secretar por la célula cancerosa. Además, dichos polipéptidos pueden expresarse no por la propia célula cancerosa, sino por células que producen y/o secretan polipéptidos que tienen un efecto potenciador o un efecto de aumento del crecimiento en células cancerosas. Dichos polipéptidos secretados son a menudo proteínas que proporcionan células cancerosas con una ventaja de crecimiento sobre las células normales e incluyen cosas, tales como factores angiogénicos, factores de adhesión celular, factores de crecimiento, y similares. Se esperaría que la identificación de antagonistas de dichos polipéptidos no asociados a membrana sirviera como agentes terapéuticos eficaces para el tratamiento de dichos cánceres. Además, la identificación del patrón de expresión de dichos polipéptidos sería útil para el diagnóstico de cánceres particulares en mamíferos.

A pesar de los avances identificados anteriormente en la terapia contra el cáncer en mamíferos, existe una gran necesidad de agentes terapéuticos adicionales capaces de detectar la presencia de tumores en un mamífero y para inhibir de manera eficaz el crecimiento de células neoplásicas, respectivamente. Por consiguiente, un objetivo de la presente solicitud es identificar polipéptidos, polipéptidos asociados a membrana, secretados o intracelulares, cuya expresión está limitada específicamente a un único tipo de tejido (o un número muy limitado de diferentes tipos de tejido) , tejidos hematopoyéticos, tanto en estado canceroso o no canceroso, y utilizar estos polipéptidos, y sus ácidos nucleicos codificantes, para producir composiciones de materia útiles en el tratamiento terapéutico y/o la detección de cáncer hematopoyético en mamíferos.

CD79 es el componente de señalización del receptor de células B que consisten en un heterodímero covalente que contiene CD79a (Igα, mb-1) y CD79b (Igβ, B29) . CD79a y CD79b contienen cada uno un dominio de inmunoglobulina (Ig) extracellular, un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular, un dominio de motivo de activación de base tirosina de inmunoreceptor (ITAM) . CD79 se expresa en células B y en células de linfoma no de Hodgkin (NHLs) (Cabezudo et al., Hoematologica, 84:413-418 (1999) ; D’Arena et al., Am. J. Hematol.,

64: 275-281 (2000) ; Olejniczak et al., Immunol. Invest., 35: 93-114 (2006) ) . CD79a y CD79b y sIg son todos necesarios para la expresión en la superficie del CD79 (Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunul., 13 (3) : 270-7) ) . La expresión promedio en superficie de CD79b en NHLs es similar a la de las células B normales, pero con un mayor intervalo (Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol., 13 (3) : 270-7 (2001) ) .

Dada la expresión de CD79b, es beneficioso producir anticuerpos terapéuticos para el antígeno de CD79b que crean una antigenicidad mínima o nula cuando se administran a pacientes, especialmente para un tratamiento crónico. La presente invención satisface esta y otras necesidades. La presente... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo anti-CD79b humanizado, que comprende:

(1) el dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 208 y el dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 207; o (2) un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 208 y un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207, en el que la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a CD79b humana es sustanciamente la misma o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 veces mayor que la afinidad de un anticuerpo murino o quimérico que comprende una secuencia variable de cadena ligera y cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 14 en su forma bivalente, en el que la afinidad de unión se expresa como un valor Kd, y en el que la afinidad de unión se mide mediante Biacore.

2. Anticuerpo anti-CD79b humanizado, que comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3: en el que HVR-L1 comprende una variante de HVR-L1 en la que la posición A9 en la secuencia A1-A15 se ha modificado a E, en la que A1-A15 es KASQSVDYDGDSFLN; en el que HVR-H3 comprende una variante de HVR-H3 en la que la posición F6 en la secuencia F1-F10 se ha modificado a I, la posición F7 se ha modificado a R y la posición F8 se ha modificado a L, en la que F1-F10 es TRRVPVYFDY; y en la que tres o cuatro de HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 y HVR-H2 se seleccionan del grupo que consiste en:

(i) HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, en la que B1-B7 es AASNLES;

(ii) HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, en la que C1-C9 es QQSNEDPLT;

(iii) HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, en la que D1-D10 es GYTFSSYWIE; y

(iv) HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, en la que E1-E18 es GEILPGGGDTNYNEIFKG; en el que la afinidad del anticuerpo en su forma bivalente a CD79b humana es sustanciamente la misma o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 veces mayor que la afinidad de un anticuerpo murino o quimérico que comprende una secuencia variable de cadena ligera y cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 14 en su forma bivalente, en el que la afinidad de unión se expresa como un valor Kd, y en el que la afinidad de unión se mide mediante Biacore.

3. Anticuerpo, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que se une al mismo epítopo que un anticuerpo monoclonal que comprende los dominios variables de SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 14.

4. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se une a un epítopo en una región de CD79b de los aminoácido.

2. 39 de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos 1-11 de la SEQ ID NO: 16.

5. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es (i) un anticuerpo monoclonal; (ii) un fragmento de anticuerpo seleccionado entre un fragmento Fab, Fab’-SH, Fv, scFv o (Fab’) 2, opcionalmente un anticuerpo monovalente o bivalente, que comprende opcionalmente una única región Fab unida a una región Fc.

6. Anticuerpo humanizado, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la secuencia de armazón de consenso kappa subgrupo I humana de cadena ligera y/o la secuencia armazón de consenso de subgrupo III humana de cadena pesada.

7. Anticuerpo humanizado, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:

(i) una secuencia de armazón de consenso kappa subgrupo I humana de cadena ligera que tiene una sustitución en la posición 4 y/o la posición 47, opcionalmente M4L y/o L47F; y/o

(ii) una secuencia armazón de consenso de subgrupo III humana de cadena pesada que tiene una sustitución en la posición 48, 67, 69, 71, 73 y/o 78, opcionalmente V48I, F67A, I69F, R71A, N73T y/o L78A.

8. Proceso para la producción de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende cultivar células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y recuperar el anticuerpo del cultivo celular.

9. Inmunoconjugado que comprende el anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, unido covalentemente a

(i) un agente citotóxico, opcionalmente un agente quimioterapéutico, un grupo farmacológico, un antibiótico, un isótopo radioactivo, y una enzima nucleolítica;

(ii) un marcador de captura, opcionalmente un marcador de captura de biotina;

(iii) un marcador de detección, opcionalmente un marcador de detección de colorante fluorescente, tal como de tipo fluoresceína, de tipo rodamina, dansilo, Lissamine, una cianina, una ficoeritrina, Texas Red, y un análogo de los mismos, o un marcador de detección de radionucleidos seleccionados entre 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, y 213Bi; en el que el anticuerpo está opcionalmente unido al marcador de detección mediante un ligando quelante, opcionalmente DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA o TETA.

10. Inmunoconjugado, según la reivindicación 9, en el que el inmunoconjugado tiene la fórmula Ab- (L-D) p, en la que:

(a) Ab es el anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;

(b) L es un enlazador; y

(c) D es un grupo farmacológico, en el que opcionalmente L es 6-maleimidocaproilo (MC) , maleimidopropanoilo (MP) , valina-citrulina (val-cit) , alaninafenilalanina (ala-phe) , p-aminobenciloxicarbonilo (PAB) , 4- (2-piridiltio) pentanoato de N-succinimidilo (SPP) , 4- (Nmaleimidometil) -ciclohexano-1-carboxilato de N-succinimidilo (SMCC) , o (4-yodo-acetil) aminobenzoato de Nsuccinimidilo (SIAB) ; y/o D es una auristatina o dolostatina.

11. Inmunoconjugado, según la reivindicación 9, que comprende un grupo farmacológico auristatina o maitansinoide (D) , en el que el anticuerpo está unido por un grupo enlazador (L) a D; teniendo el compuesto la fórmula I:

Ab- (L-D) p I

en la que p es 1 a 8, en que opcionalmente

(i) L tiene la fórmula:

- Aa-Ww-Yy

en la que:

A es una unidad de extensión;

a es 0 ó 1;

cada W es independientemente una unidad de aminoácido; w es un número entero que varía de 0 a 12; Y es una unidad espaciadora unida covalentemente al grupo farmacológico; e y es 0, 1ó 2.

(ii) el compuesto inmunoconjugado tiene la fórmula:

(iii) L es SMCC, SPP o SPDB;

(iv) D es MMAE, que tiene la estructura:

en que la línea ondulada indica el sitio de unión al enlazador L;

(v) D es MMAF, que tiene la estructura:

en que la línea ondulada indica el sitio de unión al enlazador L;

(v) D es DM1 o DM4, que tienen las estructuras:

en las que la línea ondulada indica el sitio de unión al enlazador L;

(vii) el compuesto inmunoconjugado se selecciona entre las estructuras:

Ab-MC-vc-PAB-MMAE

en las que Val es valina y Cit es citrulina; y/o (viii) L es MC-val-cit-PAB o MC.

12. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o el inmunoconjugado, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, y un portador farmacéuticamente aceptable,

opcionalmente en combinación con un agente citotóxico.

13. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o el inmunoconjugado, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para utilizar como medicamento, opcionalmente en combinación con un agente citotóxico.

14. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o el inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para utilizar en un método de tratamiento de un trastorno proliferativo, opcionalmente en combinación con un agente citotóxico.

15. Anticuerpo o inmunoconjugado para utilizar como medicamento, según la reivindicación 14, en el que dicho trastorno proliferativo es cáncer, opcionalmente linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo recidivante, NHL indolente recidivante, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de célula de manto.

16. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o el inmunoconjugado, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para utilizar en la inhibición del crecimiento de una célula tumoral que expresa CD79b.

17. Método de determinación de la presencia de una proteína CD79b en una muestra sospechosa de contener dicha proteína, comprendiendo dicho método exponer dicha muestra a un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o el inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, y determinar la unión de dicho anticuerpo o inmunoconjugado a dicha proteína CD79b en dicha muestra, en el que la unión del anticuerpo a dicha proteína es indicativa de la presencia de dicha proteína en dicha muestra; en el que la muestra es opcionalmente de un paciente sospechoso de tener un trastorno proliferativo de células B, opcionalmente linfoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , NHL agresivo, NHL agresivo recidivante, NHL indolente recidivante, NHL refractario, NHL indolente refractario, leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeño, leucemia, leucemia de célula pilosa (HCL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , y linfoma de célula de manto.

18. Método in vitro de inhibición del crecimiento de una célula que expresa CD79b, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o el inmunoconjugado, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicha célula es opcionalmente una célula B y/o una célula tumoral.

19. Método de detección de la presencia de CD79b en una muestra biológica que comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-CD79b, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o el inmunoconjugado, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, bajo condiciones que permiten la unión del anticuerpo anti-CD79b a CD79b, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-CD79b o el inmunoconjugado y CD79b.

Secuencia señal Aminoácidos 1-28

Dominio transmembrana Aminoácidos 5-25.

15. 179

Dominio de inmunoglobulina Aminoácido.

5. 124

Motivo de activación de base tirosina de inmunoreceptor Aminoácido.

19. 213

Sitio de N-glicosilación Aminoácido.

7. 76.

10. 104.

12. 130.

12. 131

Sitio de fosforilación de proteína quinasa C Aminoácido.

4. 51.

6. 62.

15. 158.

21. 214

Sitio de fosforilación de caseína quinasa II Aminoácido.

9. 102.

15. 159.

20. 209.

22. 224

Sitio de fosforilación de tirosina quinasa Aminoácido.

11. 120

Sitio de N-miristoilación Aminoácido.

4. 45.

11. 123

Secuencia señal Aminoácidos 1-26

Dominio transmembrana Aminoácido.

16. 181

Dominio de inmunoglobulina Aminoácido.

5. 126

Motivo de activación de base tirosina de inmunoreceptor Aminoácido.

19. 215

Dominio grupo V de inmunoglobulinas Aminoácido.

4. 145

Sitio de N-glicosilación Aminoácido.

7. 73.

10. 106

Sitio de fosforilación de proteína quinasa dependiente de AMPc y CMPC Aminoácido.

8. 84

Sitio de fosforilación de proteína quinasa C Aminoácido.

5. 52.

6. 63.

8. 86.

15. 160.

21. 216

Sitio de fosforilación de caseína quinasa II Aminoácido.

2. 25.

8. 87.

15. 161.

20. 211.

22. 226

Sitio de fosforilación de tirosina quinasa Aminoácido.

11. 122

Sitio de N-miristoilación Aminoácido.

4. 46.

12. 125