Virus de la hepatitis C capaz de replicación y métodos de uso.

Un polinucle6tido capaz de replicaciOn que comprende:

una regi6n 5' no traducida (NTR),

una 3' NTR, y una secuencia codificante presente entre las 5' NTR y3' NTR y codificando una poliproteina del virus de la hepatitis C, donde la poliproterna comprende unaisoleucina en lugar de la serina correspondiente a la serina 2204 de la SEC ID N 0: 2, y una arginina enlugar de la glutamine correspondiente a glutamine 1067 de la SEC ID N 0: 2, en la que la 5' NTR, la 3'NTR y la secuencia de nucleetidos que codifica la poliproteIna son genotipos la, en la que elpolinucle6tido capaz de replicaci6n se replica en celulas Huh7, y en la que la poliproteina comprendeuna secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90% de identidad con la SEC ID N °: 2.

ANTECEDENTES [0001] El virus de la hepatitis C es la causa más común de hepatitis vírica crónica en los Estados Unidos, que aproximadamente infecta a 4 millones de estadounidenses y es el responsable de la muerte de 8.000-10.000 personas al año debido a fibrosis hepática progresiva que conduce a cirrosis y/o desarrollo de carcinoma hepatocelular. El virus de hepatitis C es un virus ARN de sentido positivo de cadena sencilla, con una longitud de genoma de unos 9, 6 kb. Se clasifica actualmente en un género separado de la familia de los flavivirus, el género Hepacivirus. El genoma del virus de hepatitis C contiene un único y gran marco de lectura abierta (ORF) que sigue a un ARN 5' No traducido de unas 342 bases conteniendo un segmento de entrada interna de ribosoma (IRES) que dirige la iniciación de la traducción vírica independiente de cap. El gran ORF codifica una poliproteína que sufre escisión post-traduccional, bajo el control de proteinasas celulares y víricas. Esto produce una serie de proteínas estructurales que incluyen un núcleo o proteína de la nucleocápside, dos glicoproteínas de envoltura, E1 y E2, Y por lo menos seis proteínas no estructurales de replicación. Estas incluyen NS2 (que con la secuencia adyacente NS3 demuestra actividad de metaloproteinasa cis-activa en el sitio de escisión NS2/NS3) , NS3 (una serina proteinasa / NTPasa / ARN helicasa) , NS4A (factor accesorio de serina proteinasa) , NS4B, NS5A y NS5B (ARN polimerasa dependiente de ARN) . [0002] Con la excepción del ARN 5' no traducido, existe una heterogeneidad genética sustancial entre diferentes cepas del virus de la hepatitis C. Los análisis filogenéticos han dado lugar a la clasificación de las cepas de virus de la hepatitis C en una serie de "genotipos" genéticamente distintos, cada uno de los cuales contiene un grupo de virus genéticamente relacionados. La distancia genética entre algunos de estos genotipos es suficientemente grande como para sugerir que puede haber diferencias serotípicas biológicamente significativas también. Hay poco conocimiento de la medida en la que la infección con un virus de cualquier genotipo puede conferir protección contra virus de un genotipo diferente. [0003] La terapia actualmente disponible de interferón en combinación con ribavirina tiene una pobre velocidad de respuesta frente a las cepas más frecuentes de VHC, genotipo 1 a y 1 b. El establecimiento de sistemas de replicón subgenómicos seleccionables ha avanzado el estudio de la replicación del ARN VHC. Sin embargo, sólo replicones de cepas de genotipo 1 b están fácilmente disponibles, y la extensión de los sistemas de replicón a otros genotipos ha sido bastante infructuosa. Teniendo en cuenta la naturaleza de la alta variabilidad genética del VHC, serán muy útiles sistemas de replicación del VHC derivados de otros genotipos en el esfuerzo de descubrimiento de fármacos. De acuerdo con esta noción, replicones quiméricos que contienen una polimerasa de genotipo 1 a en el antecedente de un replicón con genotipo 1 b eran más resistentes al tratamiento con interferón in vitro que el replicón derivado de un genotipo 1 b del VHC. La extensión del sistema de replicón a otros genotipos también es necesaria para entender el mecanismo de la replicación del

ARN del VHC y la contribución de las secuencias variables en ese proceso. [0004] Recientemente, dos grupos informaron de la generación del sistema de replicación del genotipo 1a usando sublineas altamente permisivas de células Huh-7. Blight y col. (J. Virol 77, 3.181-3.190 (2003) ) fueron capaces de seleccionar colonias resistentes de G418 soportando la replicación de un genotipo derivado de replicones subgenómicos 1a de una sublinea Huh7 hiper-permisiva, Huh-7.5, que fue generada curando una linea celular establecida de replicón resistente a G418 del ARN replicón subgenómico Con1 que se habla utilizado para seleccionarlo mediante tratamiento con interferón-alfa (Tizón et al., J. Virol., 76, 13001-13014 (2002) ) . El análisis de secuencia de ARNs de VHC replicantes en el interior de dichas lineas celulares seleccionadas mostró que las mutaciones críticas más comunes se encuentran en la posición de aminoácido 470 de NS3 (P1496L) dentro del dominio II de la helicasa NS3, y la mutación NS5A (S22041) . En otro caso,

Grobler y col. (J. Biol.. Chem .. , 278, 16741-16746 (febrero de 2003) ) , utilizaron un enfoque sistemático mutacional para llegar a una conclusión similar de que la combinación de ambos P1496L y S22041 era necesaria para conseguir la replicación del genotipo 1a en una sublfnea Huh-7altamente permisiva que se seleccionó de forma independiente pero similar. Sin embargo, ARNs de genotipo 1a con estas dos mutaciones mejoradas no sufren replicación en la linea celular Huh-7 indicando una utilidad limitada de este sistema.

RESUMEN

La presente invención proporciona polinucleótidos capaces de replicación de acuerdo con la reivindicación 1. Los polinucleótidos capaces de replicación incluyen una región no traducida 5' (NTR) , una NTR 3', Y una primera secuencia codificante presente entre la NTR 5' Y la NTR 3' Y que codifica una 10 poliprotelna del virus de la hepatitis C. La NTR 5', la NTR 3', Y la secuencia de nucleótido que codifican la poliprotelna son genotipo 1 a. La poliprotelna incluye una isoleucina aproximadamente en el aminoácido 2204, e incluye además una mutación adaptativa en la que la mutación adaptativa es una arginina en aproximadamente el aminoácido 1067. La poliprotelna puede ser una poliprotelna subgenómica. La poliprotelna puede incluir el núcleo de productos de escisión, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y

NS5B. Los polinucleótidos capaces de replicación pueden incluir además una segunda secuencia de codificación. La segunda secuencia de codificación puede codificar, por ejemplo, un marcador o un transactivador. Los polinucleótidos capaces de replicación pueden incluir además una secuencia de nucleótidos que tiene actividad de ribozima que actúa en cis, en la que la secuencia de nucleótidos se localiza 3'de la NTR 3'.

También se proporcionan por la presente invención métodos para fabricar un polinucleótido capaz de replicación según la reivindicación 11, Y el polinucleotido capaz de replicación resultante. Los métodos incluyen proporcionar un polinucleótido que tiene una NTR 5', NTR 3', una primera secuencia codificante presente entre la NTR 5' Y NTR 3' Y que codifica una poliproteina del virus de la hepatitis C. La NTR 5', la poliprotelna y NTR 3' son de genotipo 1 a. La poliprotelna incluye una serina en aproximadamente el

aminoácido 2204 y una glutamina en aproximadamente el aminoácido 1067, Y el método incluye alterar la secuencia de codificación de forma que la poliprotelna codificada por ello incluye una isoleucina en el aminoácido 2204, y una glutamina en el aminoácido 1067. La poliprotelna puede ser una poliprotelna subgenómica. La poliprotelna puede incluir el núcleo de productos de escisión, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A Y NS5B.

La presente invención proporciona además métodos para identificar un compuesto que inhibe la replicación de un polinucleótido capaz de replicación tal como se define en la reivindicación 1. El método incluye poner en contacto una célula que contiene un polinucleótido capaz de replicación con un compuesto, incubar la célula bajo condiciones en las que el polinucleótido capaz de replicación se replica en ausencia del compuesto, y detectar el polinucleótido capaz de replicación, en el que una disminución del polinucleótido VHC capaz de replicación en la célula puesta en contacto con el compuesto comparado con el polinucleótido capaz de replicación en una célula no puesta en contacto con el compuesto indica que el compuesto inhibe la replicación del polinucleótido capaz de replicación. La detección del polinucleótldo capaz de replicación puede incluir, por ejemplo, amplificación de ácido nucleico o identificar un marcador codificado por el polinucleótido capaz de replicación o por la célula que contiene el polinucleótido capaz de replicación.

También se proporcionan por la presente invención métodos para seleccionar un polinucleótido capaz de replicación. El método incluye incubar una célula que contiene un polinucleótido que incluye una NTR 5', una NTR 3', Y una primera secuencia de codificación presente entre la NTR 5' Y la NTR 3 Y que codifica una poliprotelna de virus de la hepatitis C como se define en la reivindicación 1, Y una segunda secuencia de codificación. La poliprotefna incluye una isoleucina en aproximadamente el aminoácido 2204, e incluye además una glutamina en aproximadamente el aminoácido 1067. La segunda secuencia de codificación codifica un marcador seleccionable que... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido capaz de replicación que comprende: una región 5' no traducida (NTR) , una 3' NTR, Y una secuencia codificante presente entre las 5' NTR Y 3' NTR Y codificando una poli proteína del virus de la hepatitis C, donde la poli proteína comprende una isoleucina en lugar de la serina correspondiente a la serina 2204 de la SEC ID N 0: 2, y una arginina en lugar de la glutamina correspondiente a glutamina 1067 de la SEC ID N 0: 2, en la que la 5' NTR, la 3' NTR Y la secuencia de nucleótidos que codifica la poliproteína son genotipos 1a, en la que el polinucleótido capaz de replicación se replica en células Huh7, yen la que la poli proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con la SEC ID N 0: 2.

2. El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 1 que comprende además una secuencia de codificación adicional.

3. El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 2 en el que la secuencia adicional de codificación codifica un marcador.

4. El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 2 en el que la secuencia adicional de codificación 15 codifica un transactivador.

5. El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 1 que comprende además una secuencia de nucleótidos que tiene una actividad de ribozima en cis, en el que la secuencia de nucleótidos se encuentra en 3' de la 3' NTR.

6. El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 1 en el que la ubicación de un aminoácido dado 20 varía en 1 ó 2 ó 3 ó 4 ó 5 residuos en comparación con la ubicación en la SEC ID N 0: 2.

7. Un polinucleótido capaz de replicación según la reivindicación 1 en el que la poliproteina codificada del virus de la hepatitis C comprende, además, una combinación de mutaciones adaptativas seleccionadas del grupo que consiste de una arginina en lugar de la lisina correspondiente a la lisina 1691 de la SEC ID N 0: 2, una valina en lugar de la fenilalanina correspondiente a fenilalanina 2080 de la SEC ID W: 2, una isoleucina en lugar de la valina correspondiente a valina 1655 de la SEC ID N°: 2, una arginina en lugar de la lisina correspondiente a lisina 2040 de la SEC ID N 0: 2, una arginina en lugar de la glicina correspondiente a glicina 1188 de la SEC ID N 0: 2.

8. Un método para producir partículas víricas, que comprende incubar una célula que comprende el polinucleótido capaz de replicación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en condiciones que permitan al polinucleótido replicar, en el que el polinucleótido capaz de replicación está presente en las partículas del virus.

9. El método de la reivindicación 8 que comprende además aislar las partículas víricas.

10. Partlculas viricas que contienen el polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 1.

11. Un método para hacer un polinucleótido capaz de replicación que comprende: proporcionar un polinucleótido que comprende una 5' NTR, 3' NTR, una secuencia codificante presente entre las 5 'NTR Y 3' NTR Y codificando una poliproteina del virus de la hepatitis C, en el que la poli proteína comprende una serina correspondiente a serina 2204 de la SEC ID N°: 2, una glutamina correspondiente a glutamina 1067 de la SEC ID N°: 2, una lisina correspondiente a lisina 1691 de la SEC ID W: 2, una fenilalanina correspondiente a fenilalanina 2080 de la SEC ID N°: 2, una valina

correspondiente a valina 1655 de la SEC ID N 0: 2, una lisina correspondiente a lisina 2040 de la SEC ID N°: 2, o una glicina correspondiente a glicina 1188 de la SEC ID N°: 2 y en el que la 5 'NTR, la poliproteína, y 3' NTR son de genotipo 1a; y alterar la secuencia codificante de tal manera que la poliprotefna codificada por ello comprende una isoleucina en lugar de la serina correspondiente a serina 2204 de la SEC ID N°: 2, y una arginina en lugar de la glutamina correspondiente a glutamina 1067 de la SEC ID N°: 2, en el que el polinucleótido capaz de replicación se replica en células Huh7, y en el que la poliprotefna comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con la SEC ID N°: 2.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además alterar la secuencia de codificación de forma que la poliproteina codificada por ello comprende una combinación de mutaciones adaptativas seleccionados del grupo que consiste de una arginina en lugar de la lisina correspondiente a lisina 1691 de la SEC ID N°: 2, una valina en lugar de la fenilalanina correspondiente a fenilalanina 2080 de la SEC ID N°: 2, una isoleucina en lugar de valina correspondiente a valina 1655 de la SEC ID N 0: 2, una arginina en lugar de la lisina correspondiente a lisina 2040 de la SEC ID N°: 2, una arginina en lugar de la glicina correspondiente a glicina 1188 de la SEC ID N°: 2.

13. Un método para identificar un compuesto que inhibe la replicación de un polinucleótido capaz de

replicación, el método comprendiendo: poner en contacto una célula que comprende un polinucleótido capaz de replicación según la reivindicación 1 con un compuesto,

incubar la célula en condiciones en las que el polinucleótido capaz de replicación replica en ausencia del compuesto; y detectar el polinucleótido capaz de replicación, en el que una disminución del polinucleótido del VHC capaz de replicación en la célula puesta en contacto con el compuesto comparado con el polinucleótido capaz de replicación en una células no contactada con el compuesto indica que el compuesto inhibe la replicación del polinucleótido capaz de replicación.

14. El método de la reivindicación 13 en el que detectar el polinucleótido capaz de replicación comprende amplificación de ácido nucleico.

15. El método de la reivindicación 13 en el que el polinucleótido capaz de replicación comprende además una secuencia de codificación que codifica un marcador, y en el que detectar el polinucleótido capaz de replicación comprende identificar el marcador.

16. El método de la reivindicación 13 en el que el polinucleótido capaz de replicación comprende además una secuencia de codificación que codifica un transactivador, en el que la célula comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de codificación transactivada que codifica un marcador detectable y una secuencia operadora unida operativa mente a la secuencia de codificación transactivada, en el que el transactivador interactúa con la secuencia operadora y altera la expresión de la secuencia de codificación transactivada, y en el que detectar el polinucleótido capaz de replicación en la célula comprende detectar el marcador detectable codificado por la secuencia de codificación transactivada.

17. Un método para seleccionar un polinucleótido capaz de replicación, el método comprendiendo:

incubar una célula en presencia de un agente de selección, en donde: la célula comprende un polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia adicional de codificación; la secuencia adicional de codificación codifica un marcador seleccionable que confiere resistencia al agente de selección; y el agente de selección inhibe la replicación de una célula que no expresa el marcador seleccionable; y detectar una célula que replica en presencia del agente de selección, en donde la presencia de dicha célula indica que el polinucleótido es capaz de replicación

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 17 en donde la célula es una célula de hepatoma humano.

19. El método de la reivindicación 17 en el que el agente de selección es un antibiótico.

20. El método de la reivindicación 17 en el que la célula es una primera célula, el método comprendiendo

además: obtener una partícula de virus producida por la primera célula; exponer una segunda célula a la partícula de virus aislada e incubar la segunda célula en presencia del agente de selección, y detectar una segunda célula que se replica en presencia del agente de selección, en donde la presencia de tal celula indica que el polinucleótido capaz de replicación en la primera célula produce una partícula de virus infeccioso.

21. Un método para detectar un polinucleótido capaz de replicación, el método comprendiendo:

incubar una célula que comprende un polinucleótido capaz de replicación, en el que: el polinucleótido capaz de replicación es un polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende además entre la NTR 5 'y 3' NTR de una secuencia de codificación adicional que codifica un transactivador; la célula comprende una región de codificación transactivada y una secuencia operadora unida operativamente a la región de codificación transactivada ; y la región de codificación transactivada codifica un marcador detectable, en donde el transactivador altera la transcripción de la región de codificación transactivada; y

detectar el marcador detectable, en el que la presencia del marcador detectable indica que la célula comprende un polinucleótido capaz de replicación.

22. Un kit que comprende: un polinucleótido capaz de replicación según la reivindicación 1 que comprende además entre las 5 'NTR Y 3' NTR, una secuencia codificante adicional que codifica un transcativador; y una célula que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de codificación transactivada que codifica un marcador detectable y una secuencia operadora unida operativamente a la secuencia de codificación transactivada, en donde el transactivador interacciona con la secuencia operadora y altera la expresión de la secuencia codificante transactivada.

23. El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 1, el método de cualquiera de las reivindicaciones 11, 13, 17 o 21 o el kit de la reivindicación 22 en los que la poliproteina del virus de la hepatitis e es una poliproteina subgenómica del virus de la hepatitis C.

24. El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 1, el método de cualquiera de las reivindicaciones 11, 13, 17 o 21 o el kit de la Reivindicación 22 en los que la poli proteína del virus de la hepatitis e comprende los productos de escisión de núcleo, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A Y NS5B.