Un nuevo gen BNO1 cartografiado en el cromosoma 16q24.3.

Una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que se cartografía en el cromosoma humano 16q24.

3 y quecomprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3.

Un nuevo gen BNO1 cartografiado en el cromosoma 16q24.3.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo gen que se ha identificado en la punta distal del brazo largo del cromosoma 16 en 16q24.3. El gen BNO1 codifica un polipéptido que forma parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en el direccionamiento de proteínas mediante ubicuitinación para una degradación en el proteasoma. Considerando que BNO1 está involucrado en la ubicuitinación y la degradación de proteínas, la invención también se refiere a la terapia de trastornos asociados con este proceso, tales como el cáncer (en particular el carcinoma de mama y de próstata) , la enfermedad inmune/inflamatoria y la enfermedad neurológica. Además, la invención se refiere al diagnóstico de trastornos asociados con la ubicuitinación y al escrutinio de fármacos para una intervención terapéutica en estos trastornos.

Técnica anterior

Se ha observado que el desarrollo de carcinomas humanos surge por una acumulación de cambios genéticos que implican agentes reguladores positivos de la función celular (oncogenes) y agentes reguladores negativos (genes supresores de tumores) . Para que una célula somática normal se desarrolle en un tumor metastásico se requieren cambios a nivel celular, tales como la inmortalización, la pérdida de inhibición por contacto y la capacidad de crecimiento invasivo, y cambios a nivel tisular, tales como evitar respuestas inmunes del hospedador y restricciones del crecimiento impuestas por las células circundantes, y la formación de un aporte de sangre para el tumor en crecimiento.

Estudios genéticos moleculares de carcinoma colorrectal han proporcionado pruebas sustanciales de que la generación de malignidad requiere la acumulación secuencial de una serie de cambios genéticos dentro de la misma célula madre epitelial del colon. Para que una célula epitelial colónica normal se convierta en un adenoma benigno, progrese a adenoma intermedio y final, y finalmente se convierta en una célula maligna, son necesarias mutaciones inactivadoras en genes supresores de tumores y mutaciones activadoras en proto-oncogenes (Fearon y Vogelstein, 1990) .

El empleo de una variedad de técnicas, tales como la pérdida de heterocigosidad (LOH) , la hibridación genómica comparativa (CGH) y estudios citogenéticos de tejidos cancerosos, beneficiándose todas ellas de anomalías cromosómicas asociadas con la célula afectada, ha ayudado a identificar una variedad de genes supresores de tumores y de oncogenes asociados con una serie de tipos de tumores.

En un aspecto, estudios de cánceres tales como retinoblastoma y carcinoma de colon han respaldado el modelo de que LOH es un episodio específico en la patogénesis del cáncer y se ha proporcionado un mecanismo para identificar los genes causantes de cáncer. Este modelo se pone de relieve aún más en el síndrome de Von Hippel-Lindau (VHL) , un trastorno raro que predispone individuos a una variedad de tumores, tales como carcinomas de células claras del riñón y tumores de células de los islotes del páncreas. Tanto los casos esporádicos como los casos heredados del síndrome muestran LOH en el brazo corto del cromosoma 3 y translocaciones somáticas que implican 3p en tumores esporádicos, y también se ha observado un ligamiento genético con la misma región en familias afectadas. El gen supresor del tumor de VHL ya se ha identificado a partir de esta región del cromosoma 3 y se han detectado mutaciones en el mismo en el 100% de los pacientes que tienen un diagnóstico clínico de enfermedad de VHL. Además, el gen de VHL se inactiva en aproximadamente el 50-80% de la forma esporádica más común de carcinoma renal de células claras.

Los determinantes genéticos implicados en el cáncer de mama no están tan bien definidos como los del cáncer de colon, debido en parte a que los estadios histológicos del desarrollo del cáncer de mama están peor caracterizados. Sin embargo, igual que con el carcinoma de colon, se cree que una tienen que estar implicados variedad de genes en una progresión por etapas, durante la génesis de tumores de mama.

Algunas mujeres parecen tener un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama. Análisis de ligamiento genético han mostrado que 5 a 10% de todos los cánceres de mama son debidos al menos a dos genes de susceptibilidad autosómicos dominantes. Generalmente, las mujeres portadoras de una mutación en un gen de susceptibilidad desarrollan cáncer de mama a una edad más temprana, en comparación con la población general, frecuentemente tienen tumores de mama bilaterales y tienen un mayor riesgo de desarrollar cánceres en otros órganos, particularmente carcinoma de ovario.

Un análisis de ligamiento genético en familias que muestran una alta incidencia de cáncer de mama de aparición temprana (antes de los 46 años de edad) fue un éxito en la cartografía del primer gen de susceptibilidad, BRCA1, en el cromosoma 17q21 (Hall et al., 1990) . Con posterioridad a esto, se cartografió el gen BRCA2 en el cromosoma 13q12q13 (Wooster et al., 1994) , confiriendo este gen una mayor incidencia de cáncer de mama masculino y una menor incidencia de cáncer de ovario, cuando se comparaba con BRCA1.

Tanto BRCA1 como BRCA2, ya han sido clonados (Miki et al., 1994; Wooster et al., 1995) y se han identificado numerosas mutaciones en estos genes en individuos susceptibles con casos familiares de cáncer de mama.

Existen otros síndromes de cáncer de mama heredado, sin embargo, son raros. Las mutaciones hereditarias en el gen TP53 se han identificado en individuos con síndrome de Li-Fraumeni, un cáncer familiar que produce neoplasias epite

liales que tienen lugar en sitios múltiples, incluyendo la mama. Del mismo modo, mutaciones de la línea germinal en el gen MMC4C1/PTEN implicado en la enfermedad de Cowden y en el gen de la ataxia telangiectasia (AT) , han mostrado que confieren un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama, entre otras manifestaciones clínicas, pero en conjunto solo representan un porcentaje bajo de las familias con una predisposición hereditaria al cáncer de mama.

Se ha mostrado que las mutaciones somáticas en el gen TP53 se producen en un alto porcentaje de individuos con cáncer de mama esporádico. Sin embargo, a pesar de que se ha observado LOH en los loci de BRCA1 y BRCA2 con una frecuencia de 30 a 40% en los casos esporádicos (Cleton-Jansen et al., 1995; Saito et al., 1993) , no hay prácticamente ninguna señal de mutaciones somáticas en el alelo conservado de estos dos genes en los cánceres esporádicos (Futreal et al., 1994; Miki et al., 1996) . Datos recientes sugieren que la metilación del ADN de la secuencia del promotor de estos genes puede ser un importante mecanismo de regulación a la baja. El uso de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción y de marcadores polimórficos de pequeñas repeticiones en tándem, ha identificado numerosas regiones con desequilibrio alélico en el cáncer de mama, lo que sugiere la presencia de genes adicionales que pueden estar implicados en el cáncer de mama. Datos compilados a partir de más de 30 estudios revelan la pérdida de ADN en al menos 11 brazos de cromosomas, con una frecuencia superior al 25%, estando regiones tales como 16q y 17p afectadas en más del 50% de los tumores (Devilee y Cornelisse, 1994; Brenner y Aldaz, 1995) . Sin embargo, se conoce que solo algunas de estas regiones albergan genes supresores de tumores, los cuales se ha mostrado que están mutados en individuos con las dos formas de cáncer de mama, esporádica (genes TP53 y RB) y familiar (genes TP53, RB, BRCA1 y BRCA2) .

Estudios citogenéticos han implicado la pérdida del brazo largo del cromosoma 16 como un episodio temprano en la carcinogénesis de mama, ya que se encuentra en tumores con pocas o ninguna otra anormalidad citogenética. Alteraciones en el cromosoma 1 y 16 también se han observado en varios casos de carcinoma ductal in situ (DCIS) , el estadio preinvasivo de carcinoma de mama ductal. Además, estudios de LOH en muestras de DCIS identificaron la pérdida de marcadores de 16q en el 29 al 89% de los casos sometidos a ensayo (Chen et al., 1996; Radford et al., 1995) . Además, el examen de tumores de otros tipos de tejido ha indicado que la LOH de 16q también se observa frecuentemente en los carcinomas de próstata, hígado, ovario y neuroectodérmicos primitivos. En conjunto, estos hallazgos sugieren la presencia de un gen que se cartografía en el brazo largo del cromosoma 16 que está involucrado de manera decisiva en el desarrollo temprano de una gran proporción de cánceres de mama, así como de cánceres de otros tipos de tejidos, pero hasta la fecha no se ha identificado un gen de este tipo.

1. Una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que se cartografía en el cromosoma humano 16q24.3 y que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3.

2. Una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3, que codifica un polipéptido capaz de formar parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en el direccionamiento de proteínas mediante ubicuitinación para una degradación en el proteasoma.

3. Una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que es al menos 95% idéntica a una molécula de ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3 y que codifica un polipéptido capaz de formar parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en el direccionamiento de proteínas mediante ubicuitinación para una degradación en el proteasoma.

4. Una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2 o 4.

5. Una molécula de ácido nucleico aislada que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3.

6. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico tal y como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, ligado funcionalmente a elementos de control adecuados.

7. Una célula aislada transformada con el vector de expresión según la reivindicación 6.

8. Una célula según la reivindicación 7, en la que la expresión de BNO1 recombinante se puede interrumpir.

9. Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, que es una célula eucariota.

10. Un método de preparación de un polipéptido codificado por cualquiera de los ácidos nucleicos según las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las etapas de:

(1) cultivar una célula tal como se define en la reivindicación 7 o 9 en condiciones eficaces para la producción del polipéptido; y

(2) recoger el polipéptido.

11. Un polipéptido aislado de BNO1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2

o 4.

12. Un polipéptido aislado de BNO1, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2 o 4, que es capaz de formar parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en la degradación de proteínas a través de la ubicuitinación.

13. Un polipéptido aislado de BNO1 capaz de formar parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en la degradación de proteínas a través de la ubicuitinación que tiene al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2 o 4.

14. Un polipéptido aislado de BNO1 que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2

o 4.

15. Un anticuerpo para la detección de BNO1 que es inmunológicamente reactivo con un polipéptido tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, preferentemente un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un fragmento de anticuerpo que incluye un fragmento Fab, un fragmento F (ab') 2, un fragmento Fv, anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos de dominio único.

16. El uso de una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con una disminución de la expresión o de la actividad de BNO1.

17. El uso según la reivindicación 16, en el que la molécula de ácido nucleico es una parte de un vector de expresión que también incluye elementos de control adecuados.

18. El uso de un antagonista de BNO1 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con el aumento de la expresión o la actividad de BNO1, en donde dicho antagonista es un anticuerpo según la reivindicación 15.

19. El uso de una molécula de ácido nucleico aislada que es el complemento de una molécula de ácido nucleico tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, cuyo producto de transcripción es un ARNm que se hibrida con el ARNm codificado por BNO1, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno

asociado con el aumento de la actividad o de la expresión de BNO1.

20. Un método para escrutar un compuesto capaz de modular la actividad de BNO1 que comprende combinar un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, y un compuesto candidato, y determinar la unión de dicho compuesto candidato con dicho péptido.

21. Un método para escrutar candidatos a fármacos que comprende las etapas de:

(1) proporcionar una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 7 o 9;

(2) añadir un candidato a fármaco a dicha célula; y

(3) determinar el efecto de dicho candidato a fármaco sobre la expresión de BNO1 en dicha célula.

22. El uso de un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para escrutar candidatos a fármacos.

23. El uso in vitro de un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para el diagnóstico o el pronóstico de trastornos asociados con una disfunción de BNO1 o una predisposición a tales trastornos.

24. El uso in vitro de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, para el diagnóstico o el pronóstico de trastornos asociados con una disfunción de BNO1 o una predisposición a tales trastornos.

25. El uso in vitro de un anticuerpo según se ha definido en la reivindicación 15, para el diagnóstico o el pronóstico de un trastorno asociado con BNO1 o una predisposición a tales trastornos.

26. Un método in vitro para el diagnóstico o el pronóstico de un trastorno asociado con mutaciones en BNO1, o una predisposición a tales trastornos en un paciente, que comprende las etapas de:

comparar BNO1 o un ácido nucleico que codifica BNO1 procedente de una muestra que se debe obtener a partir de un paciente con BNO1 de tipo silvestre o un ácido nucleico que lo codifica con el fin de establecer si la persona expresa un BNO1 mutante.

27. Un método según la reivindicación 26, en el que se compara la secuencia de nucleótidos del ADN del paciente con la secuencia de ADN que codifica BNO1 de tipo silvestre.

28. Un método in vitro para el diagnóstico o el pronóstico de un trastorno asociado con una expresión o una actividad anormal de BNO1, o una predisposición a tales trastornos, que comprende las etapas de:

(1) establecer un perfil para la expresión normal de BNO1 en sujetos no afectados;

(2) medir el nivel de expresión de BNO1 en una persona sospechosa de tener una expresión o actividad anormal de BNO1; y

(3) comparar el nivel de expresión medido con el perfil de expresión normal.

29. Un método según la reivindicación 28, en el que se emplea una transcriptasa inversa-PCR para medir los niveles de expresión.

30. Un método según la reivindicación 28, en el que un ensayo de hibridación que utiliza una sonda obtenida a partir de BNO1, o un fragmento del mismo, se emplea para medir los niveles de expresión.

31. Un método según la reivindicación 30, en el que la sonda tiene al menos 50% de identidad de secuencia con una secuencia nucleotídica que codifica BNO1, o un fragmento del mismo.

32. Un método in vitro para el diagnóstico o el pronóstico de un trastorno asociado con BNO1, o una predisposición a tales trastornos, que comprende las etapas de:

(1) establecer una propiedad física de BNO1 de tipo silvestre;

(2) medir la propiedad de un BNO1 expresado por una persona que es sospechosa de tener una anormalidad de BNO1; y

(3) compararla con la propiedad establecida para BNO1 de tipo silvestre con el fin de establecer si la persona expresa un BNO1 mutante.

33. Un método según la reivindicación 32, en el que la propiedad es la movilidad electroforética.

34. Un método según la reivindicación 32, en el que la propiedad es el patrón de escisión proteolítica.

35. Un animal no humano modificado genéticamente seleccionado entre el grupo que consiste en ratas, ratones,

hámsteres, cobayas, conejos, perros, gatos, cabras, ovejas, cerdos y primates no humanos tales como monos y chimpancés, transformado con una molécula de ácido nucleico aislada tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

36. Un animal no humano modificado genéticamente seleccionado entre el grupo que consiste en ratas, ratones,

hámsteres, cobayas, conejos, perros, gatos, cabras, ovejas, cerdos y primates no humanos tales como monos y chimpancés, en el que el gen BNO1 homólogo y la función génica se han desactivado.

37. El uso de un animal no humano modificado genéticamente tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 35 o 36, en el escrutinio en busca de compuestos farmacéuticos candidatos.

38. Una micromatriz para detectar BNO1 que comprende un ácido nucleico que codifica o bien una isoforma de

BNO1, o un fragmento de la misma, o ácidos nucleicos que codifican ambas isoformas de BNO1, o fragmentos de las mismas.