Truncamientos y proteínas recombinantes de Porphyromonas gingivalis.

Un polipéptido soluble de P. gingivalis que consiste en un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada delgrupo que consta de los residuos 86 a 223 de la SEC ID nº 3,

los residuos 191-322 de la SEC ID nº 3, los residuos224-391 de la SEC ID nº 3, los residuos 213-380 de la SEC ID nº 4, los residuos 224-306 de la SEC ID nº 3, y losresiduos 281 a 384 de la SEC ID nº 3, o una variante de dicha secuencia que es capaz de generar una respuestainmune contra P. gingivalis, en el que el polipéptido soluble no es una proteína de fusión de los residuos 192 a 290de la adhesina r-Rgp44 de P. gingivalis vinculada a los residuos 286-380 de la SEC ID nº 4.

Truncamientos y proteínas recombinantes de Porphyromonas gingivalis

Campo de la invención La presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos de P. gingivalis y a polipéptidos de P. gingivalis. Los polipéptidos y nucleótidos de P. gingivalis se pueden utilizar en compuestos para su uso en generar una respuesta inmune en un sujeto contra P. gingivalis y para tratamiento, prevención o reducción de la gravedad de la afección conocida como periodontitis o de otras afecciones relacionadas con la infección con P. gingivalis.

Antecedentes de la invención Las enfermedades periodontales son enfermedades inflamatorias asociadas a infección bacteriana de los tejidos de soporte de los dientes, y abarcan desde la forma relativamente suave de la gingivitis, la inflamación reversible inespecífica de tejido gingival, hasta las formas más agresivas de la periodontitis que se caracterizan por la destrucción de las estructuras de soporte del diente. La periodontitis se asocia con una infección subgingival de un consorcio de bacterias específicas gramnegativas que lleva a la destrucción del periodonto y que supone un problema principal de salud pública. Una bacteria que ha atraído un considerable interés es P. gingivalis, ya que la recuperación de este microorganismo en lesiones de periodontitis del adulto puede ser de hasta el 50% de la flora subgingival anaeróbicamente cultivable, mientras que P. gingivalis rara vez es recuperable, luego en bajo número, de sitios sanos. Un aumento proporcional en el nivel de P. gingivalis en la placa subgingival se ha asociado con un aumento de la gravedad de la periodontitis, y la erradicación del microorganismo de la población microbiana subgingival cultivable se acompaña de la solución de la enfermedad. La progresión de las lesiones de periodontitis en primates no humanos se ha demostrado con la implantación subgingival de P. gingivalis. Estos hallazgos tanto en animales como en seres humanos sugieren un papel principal de P. gingivalis en el desarrollo de la periodontitis en el adulto.

Más recientemente, ha habido un aumento de la vinculación de la enfermedad periodontal con la enfermedad

cardiovascular y, por lo tanto, del vínculo entre la infección por P. gingivalis y la enfermedad cardiovascular. Se puede encontrar más información con relación a esta vinculación en Beck JD et al. Ann Periodontol 3: 127-141, 1998 y en Beck J et al. J. Periodontol. 67; 1123-37, 1996.

P. gingivalis es un bacilo anaeróbico asacarolítico proteolítico gramnegativo pigmentado de negro que obtiene energía a partir del metabolismo de aminoácidos específicos. El microorganismo tiene un requisito absoluto de hierro para el crecimiento, preferentemente en forma de hemo o de su producto de oxidación de Fe (III) hemina, y cuando crece bajo condiciones de exceso de hemina es altamente virulenta en animales experimentales. Varios factores de virulencia han sido implicados en la patogenicidad de P. gingivalis incluyendo la cápsula, las adhesinas, las citotoxinas y las enzimas hidrolíticas extracelulares.

Con el fin de desarrollar una vacuna eficaz y segura para prevenir, eliminar o reducir la colonización de P. gingivalis, es necesario identificar y producir antígenos que están implicados en la virulencia y que tienen utilidad como inmunógenos posiblemente a través de la generación de anticuerpos específicos. Si bien es posible intentar aislar antígenos directamente a partir de cultivos de P. gingivalis, esto es, a menudo, difícil. Por ejemplo, como se 45 mencionó anteriormente, P. gingivalis es un anaerobio estricto y puede ser difícil de aislar y de hacerlo crecer. Es también conocido que, para varios organismos, cuando se cultivan in vitro, muchos genes de virulencia están regulados y las proteínas codificadas ya no se expresan. Si se aplicaron técnicas de química convencionales para purificar candidatos potencialmente importantes de vacunas, las moléculas (protectoras) no se pueden identificar Con la secuenciación de ADN, ya que el gen está presente (pero no transcrito) incluso cuando el organismo se hace 50 crecer in vitro, puede ser identificado, clonado y producido como una proteína de ADN recombinante. Del mismo modo, un antígeno protector o un objetivo terapéutico se puede expresar transitoriamente por el organismo in vitro o producirse en bajos niveles, haciendo la identificación de estas moléculas extremadamente difícil por métodos convencionales.

Con la identificación serológica de objetivos terapéuticos, uno se limita a esas respuestas que son detectables usando métodos estándares tales como Western blot o ELISA. La limitación aquí es tanto el nivel de respuesta que se genera por el animal o por el ser humano como determinar si esta respuesta es protectora, perjudicial o irrelevante. Una limitación tal no está presente con un enfoque de secuenciación para la identificación de los posibles objetivos terapéuticos o profilácticos.

También es bien conocido que P. gingivalis produce una gama de proteasas ampliamente activas (solicitud internacional de patente nº WO 97/16542, y patentes de EE.UU. nº 5.475.097 y nº 5.523.390) , que hacen difícil la identificación de proteínas intactas debido a su degradación por estas proteasas. El documento WO 01/47961 es parte de la técnica anterior de acuerdo con el artículo 54 (3) CPE y describe una proteína de fusión de los residuos 65 192 a 290 de la adhesina r-Rgp44 de P. gingivalis enlazada a los residuos 286 a 380 de la SEC ID nº 4 .

Sumario de la invención Los presentes inventores han identificado ahora fragmentos de las proteínas PG32 y PG33 de P. gingivalis que exhiben una solubilidad mejorada en comparación con las proteínas en toda su longitud. Usando un modelo murino 5 de lesión de infección, los presentes inventores han encontrado que estos fragmentos solubles son capaces de proteger contra la exposición a P. gingivalis.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido soluble de P. gingivalis que consiste en un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consta de los residuos 86 a 223 de la SEC ID nº 3,

los residuos 191-322 de la SEC ID nº 3, los residuos 224-391 de la SEC ID nº 3, los residuos 213-380 de la SEC ID nº 4, los residuos 224-306 de la SEC ID nº 3 y los residuos 281-384 de la SEC ID nº 3, o una variante de dicha secuencia que es capaz de generar una respuesta inmune contra P. gingivalis, en el que la variante no es una proteína de fusión de los residuos 192 a 290 de la adhesina r-Rgp44 de P. gingivalis enlazada a los residuos 286380 de la SEC ID nº 4.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una construcción quimérica o de fusión que comprende un polipéptido soluble del primer aspecto.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ADN aislada, comprendiendo la molécula 20 de ADN una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido soluble del primer aspecto.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un vector recombinante de expresión que comprende la molécula de ADN del tercer aspecto de la presente invención enlazada operativamente a un elemento regulador de la transcripción.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una célula que comprende un vector recombinante de expresión del cuarto aspecto.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un polipéptido de P. gingivalis que 30 comprende cultivar una célula del quinto aspecto bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona una composición para su uso en generar una respuesta inmune provocada, bajo P. gingivalis, en un sujeto, comprendiendo la composición una cantidad eficaz de al menos un polipéptido del primer aspecto, y/o al menos una molécula de ADN del tercer aspecto de la presente invención, y

un portador farmacéuticamente aceptable.

En una realización preferida del séptimo aspecto, el portador farmacéuticamente aceptable es un adyuvante.

En un octavo aspecto, la presente invención proporciona una composición del séptimo aspecto para su uso en la 40 reducción o la prevención de la incidencia o de la gravedad de la infección por P. gingivalis en un sujeto.

Dado el aumento de vinculación de la enfermedad periodontal con la enfermedad cardiovascular (ECV) , y la posible relación, por lo tanto, de la infección por P. gingivalis con las ECV, la composición del séptimo aspecto de la presente invención puede usarse también en la terapia profiláctica para reducir la incidencia o la gravedad de las 45 ECV o como un complemento en el tratamiento... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido soluble de P. gingivalis que consiste en un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consta de los residuos 86 a 223 de la SEC ID nº 3, los residuo.

19. 322 de la SEC ID nº 3, los residuos 224-391 de la SEC ID nº 3, los residuo.

21. 380 de la SEC ID nº 4, los residuo.

22. 306 de la SEC ID nº 3, y los residuos 281 a 384 de la SEC ID nº 3, o una variante de dicha secuencia que es capaz de generar una respuesta inmune contra P. gingivalis, en el que el polipéptido soluble no es una proteína de fusión de los residuos 192 a 290 de la adhesina r-Rgp44 de P. gingivalis vinculada a los residuo.

28. 380 de la SEC ID nº 4.

2. Una construcción quimérica o de fusión que comprende un polipéptido soluble de la reivindicación 1.

3. Una molécula aislada de ADN, comprendiendo la molécula de ADN una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido soluble de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2.

4. Un vector recombinante de expresión que comprende la molécula de ADN de la reivindicación 2, vinculado operativamente a un elemento regulador de la transcripción.

5. Una célula que comprende el vector recombinante de expresión de la reivindicación 4.

6. Un método para producir un polipéptido de P. gingivalis, que comprende cultivar la célula de la reivindicación 5 bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido.

7. Una composición para su uso en generar una respuesta inmune dirigida contra P. gingivalis en un sujeto,

comprendiendo la composición una cantidad eficaz de al menos un polipéptido soluble de la reivindicación 1 y/o al 25 menos una molécula de ADN de la reivindicación 3, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Una composición según la reivindicación 7, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un adyuvante.

9. Una composición según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, para su uso en la reducción o en la prevención de 30 la incidencia o de la gravedad de la infección por P. gingivalis en un sujeto.

10. Un anticuerpo generado y dirigido contra un polipéptido soluble, consistiendo el polipéptido en una secuencia seleccionada del grupo que consta de los residuo.

19. 322 de la SEC ID nº 3, los residuo.

22. 391 de la SEC ID nº 3, los residuo.

21. 380 de la SEC ID nº 4, los residuo.

22. 306 de la SEC ID nº 3, y los residuo.

28. 384 de la SEC

ID nº 3.

11. Un anticuerpo según la reivindicación 10, que es un anticuerpo monoclonal.

12. Un anticuerpo según la reivindicación 10, que es un anticuerpo policlonal. 40

13. Una composición que comprende el anticuerpo de las reivindicaciones 10, 11 o 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Un anticuerpo según las reivindicaciones 10, 11 o 12, para su uso en el tratamiento o en la prevención de la

infección por P. gingivalis en un sujeto, en el que el anticuerpo se genera y se dirige contra un polipéptido soluble que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consta de los residuos 224 a 391 de la SEC ID nº 3 y los residuo.

21. 380 de la SEC ID nº 4.

15. Un método de diagnóstico para detectar la presencia o ausencia de un polipéptido de P. gingivalis en una 50 muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con el anticuerpo de la reivindicación 10, 11 o 12 bajo condiciones suficientes para que el anticuerpo forme un complejo inmune con un polipéptido de P. gingivalis de la muestra, y detectar la presencia o ausencia de un complejo inmune.

16. Un método de diagnóstico para detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo de P. gingivalis en una 55 muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con el polipéptido soluble de la reivindicación 1 o con la construcción quimérica o de fusión de la reivindicación 2, bajo condiciones suficientes para que el fragmento soluble del polipéptido forme un complejo inmune con un anticuerpo de la muestra, y detectar la presencia o ausencia de un complejo inmune.

17. Un equipo que comprende el polipéptido soluble de la reivindicación 1, o la construcción quimérica o de fusión de la reivindicación 2, y/o el anticuerpo de las reivindicaciones 10, 11 o 12.

18. El uso del polipéptido de la reivindicación 1 para generar un anticuerpo.