Muteínas de citocina.

Una muteína de IL-11 que muestra unión potenciada a la cadena alfa del receptor de IL-11,

en la que la secuencia de aminoácidos AMSAG en la posición 58 a 62 de IL-11 de mamífero de tipo salvaje está sustituida por la secuencia de aminoácidos PAIDY o FMQIQ.

Muteínas de citocina DATOS DE LA SOLICITUD

Esta solicitud está asociada con y reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional U S. n° 61/000.576, presentada el 26 de octubre de 2007.

CAMPO

La presente Invención se refiere generalmente al tratamiento de una afección mediada por interleucina-11 (IL-11). Más particularmente, la presente invención proporciona el uso de formas modificadas de IL-11 que modulan la señalización de IL-11 en el tratamiento de afecciones mediadas por IL-11.

ANTECEDENTES

Los detalles bibliográficos de referencias proporcionadas en la presente memoria descriptiva se dan al final de la memoria descriptiva.

La referencia a cualquier técnica anterior no se toma, y no se debería de tomar como reconocimiento o ninguna forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en ningún país.

La ¡nterleuclna-11 (IL-11) es un miembro de la familia de citocinas IL-6, que incluye IL-6, IL-6 viral (vlL-6), factor Inhibidor de leucemia (LIF), oncostatina M (OSM), factor neurotrófico ciliar (CNTF), cardiotrofina-1 (CT-1), citosina similar a cardiotrofina/factor 1 similar a citocina (CLC/CLF), IL-27 y neuropoyetina (NP). IL-11 es capaz de estimular el crecimiento y diferenciación de diversas estirpes de células hematopoyéticas, ya sea sola o sinèrgicamente con otras citocinas. IL-11 es también capaz de estimular la megacariopoyesis y la producción de plaquetas, y se usa clínicamente para prevenir trombocitopenia inducida por quimioterapia (Tepleretal, Blood 87(9):3607-3614, 1996), y está siendo actualmente evaluada como un nuevo enfoque para el tratamiento de mucositis gastrointestinal inducida por quimioterapia (Herrllnger et al, Am J Gastroenterol 101(4):793-797, 2006). También se ha sugerido que IL-11 es beneficiosa en artritis y enfermedad inflamatoria del intestino.

IL-11 también ejerce una variedad de actividades biológicas fuera del sistema hematopoyético. Es un regulador del desarrollo de osteoclastos, y se cree que es un regulador del metabolismo óseo (Girasole et al, J clin Invest 93:1516- 1524, 1994; Hughes et al, Calcif tissue Int 53:362-364, 1993; Heymann y Rousselle, Cytokine 12(10):1455-1468, 2000). IL-11 se expresa en niveles elevados en células del SNC (Du et al, J Celi Physiol 168:362-372, 1996), y estimula la supervivencia y proliferación de células progenitoras neuronales (Mehler et al, nature 362:62-65, 1993). En ratones hembra, IL-11 es esencial para la implantación con éxito del embrión (Dimitriadeis et al, Mol Hum Reprod. 6(10):907-914, 2000; Robb et al, Nat Med 4:303-308, 1998; Bilinski et al, Genes Dev 12:2234-2243, 1998), y el patrón de expresión de IL-11 y sus receptores durante el ciclo menstrual sugiere un papel similar en seres humanos. Otras actividades no hematopoyéticas de IL-11 incluyen la inhibición de adipogénesis (Ohsumi et al, FEBS Lett 288:13-16, 1991; Ohsumi et al, Biochem Mol Biol Int 32:705-712, 1994), inducción de una respuesta febril (Lopez-Valpuesta et al, Neruopharmacology 33:989-994, 1994), modulación del metabolismo de la matriz extracelular (Maier et al, J Biol chem. 268:21527-21532, 1993), la estimulación de agentes reaccionantes de fase aguda (Baumann y Schendel, J Biol Chem 266:20424020427 1991), y papeles pro- y antiinflamatorios propuestos (Trepicchio et al, J Clin Invest 104:1527-1537, 1999; Redlichetal.JImmunol 157:1705-1710, 1996).

También se ha sugerido a IL-11 como un agente terapéutico potencial en otros diversos trastornos inflamatorios, Incluyendo daño pulmonar inducido por radiación (Redlich et al, más arriba, 1996), septicemia (Chang et al, Blood Cells Mol Dis 22(1):57-67, 1996) y psoriasis (Trepicchio et al, más arriba, 1999). La patente US n° 6.270.759 sugiere que IL-11 puede ser terapéuticamente útil para una variedad de afecciones inflamatorias, incluyendo asma y rinitis.

Indicativa del interés terapéutico en IL-11, la Solicitud de Patente US n° 2007/0190024 describe formas modificadas de IL-11 con mutaciones en His 182 (H182) y Asp 186 (D186), que actúan como agonistas e hiperagonistas de IL-

11.

IL-11 ejerce sus efectos vía asociación con un receptor específico de la superficie celular (IL-11 Ra) así como la subunidad receptora compartida gp130. Mientras todas las citocinas de la familia IL-6 señalan a través de complejos receptores que implican una o más moléculas de gp130, el complejo de señalización de IL-11 es muy similar al de IL-6 por cuanto comprende dos moléculas de cada citocina, el receptor de la cadena a específico y gp130 (Barton et al, J Biol Chem (2000) 275:36197-36203, 2000).

Mientras que los anticuerpos neutralizantes y las proteínas receptoras solubles son estrategia habitual para inhibir citocinas, una tercera clase de moléculas antagonistas se denomina como "muteínas de citocina", que previenen la señalización mediante la unión a solamente una de las dos cadenas receptoras. Se ha descrito previamente un número de estas muteínas, y una, una variante antagonista de la hormona del crecimiento, se usa clínicamente para tratar acromegala (Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085, 1989). Dentro de la familia de citocinas IL-6, se

han descrito muteínas de citocina para IL-6, CNTF, LIF e IL-11 (Ehlers et al, J Biol Chem 270:8158-8163, 1995; Brakenhoff et al, J Blol Chem 269:86-93, 1994; Savlno et al, Embo J 13:5863-5870, 1994; Fludson et al, J Blol Chem 271:11971-11978, 1996; Sagglo et al, Embo J 14; 3045-3054, 1995; Underhill-Day et al, Endocrinology 144; 3406- 3414, 2003). En cada caso, estas muteínas de citocina contienen mutaciones específicas que previenen la unión de citocina a gp130. En el caso de IL-11, una única mutación de punto, W147A (una sustitución de trlptófano por alanina en el resto de aminoácido 147), es suficiente para convertir IL-11 de un agonista a un antagonista de la señalización de IL-11 con la afinidad por IL-11 Ra sin cambiar (Underhill-Day et al, más arriba 2003).

Además, estudios de estructura y función han Identificado diversas regiones de IL-11 murina y humana que son Importantes para la unión a IL-11Ra (Czupryn et al, J. Blol. Chem. 270 (2): 978-985, 1995; Miyadal et al, Blosci. Biotechnol. Biochem. 60.3:541-542, 1996; Czupryn et al, Ann. N.Y. Acad. Sci. 762:152-164, 1995; Tacken et al, Eur. J. Biochem. 265.2:645-655, 1999; Flarmegnles et al, Biochem J. 375(1 ):23-32, 2003). En particular, se encontró que los restos D165, W166, R169, L172 y L173 en el extremo C-termlnal de la hélice D, y M58, L64 y L67 en el bucle A- B contribuyen a la unión a IL-11Ra.

La Solicitud de Patente US n° 2007/0190024 describe muteínas de IL-11 con mutaciones en His 182 (H182) y Asp 186 (D186) de IL-11 como agonistas e hlperagonlstas de IL-11, pero no sugiere antagonistas. La muteína de IL-11, W147A IL-11, es una variante antagonista de IL-11 que previene el reclutamiento de gp130 al complejo receptor de IL-11 (Underhill-Day et al, más arriba 2003), previniendo de ese modo la señalización de IL-11. Sin embargo, W147A IL-11 tiene la misma afinidad por IL-11 Ra que IL-11 de tipo salvaje.

Flay un papel para los moduladores de IL-11 en terapia. Es necesaria la identificación de moduladores adicionales de IL-11.

SUMARIO

A lo largo de esta memoria descriptiva, excepto que el contexto lo requiera de otro modo, la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros, pero no la exclusión de ningún otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

Las secuencias nucleotídlcas y de aminoácidos se citan mediante un número identificador de secuencia (SEC ID NO ). Los SEC ID NOs: corresponden numéricamente a los identificadores de secuencias <400>1 (SEC ID NO:1), <400>2 (SEC ID NO:2), etc. En la Tabla 1 se proporciona un resumen de los identificadores de secuencias. Después de las reivindicaciones se proporciona un listado de secuencias.

La presente Invención se refiere generalmente a formas modificadas de interleucina-11 de mamífero (en lo sucesivo denominadas aquí "muteínas de IL-11") que muestran unión potenciada a la cadena alfa del receptor de IL-11 (IL- 11 Ra). Más particularmente, las muteínas de IL-11 de la presente invención modulan la señalización de IL-11, y por lo tanto son útiles como sustancias terapéuticas en el tratamiento o profilaxis de afecciones mediadas por IL-11. Por "modular" se quiere decir aumentar ("agonizar") o disminuir ("antagonizar").

En consecuencia, la presente Invención proporciona una muteína de IL-11 que comprende una secuencia de aminoácidos en la que la secuencia de aminoácidos AMSAG (usando... [Seguir leyendo]

I. Una muteína de IL-11 que muestra unión potenciada a la cadena alfa del receptor de IL-11, en la que la secuencia de aminoácidos AMSAG en la posición 58 a 62 de IL-11 de mamífero de tipo salvaje está sustituida por la secuencia de aminoácidos PAIDY o FMQIQ.

5 2. La muteína de IL-11 de la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos AMSAG está sustituida por

PAIDY.

3. La muteína de IL-11 de la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos AMSAG está sustituida por FMQIQ.

4. La muteína de IL-11 de la reivindicación 1 ó 2 ó 3, que comprende además una mutación en un trlptófano (W) en 10 una posición de aminoácido 147 de IL-11 de tipo salvaje, mutación la cual inhibe la unión de la muteína de IL-11 a

gp130.

5. La muteína de IL-11 de la reivindicación 4, en la que la mutación adicional es una sustitución de aminoácido.

6. La muteína de IL-11 de la reivindicación 5, en la que la sustitución es a una alanina (A) o cisterna (C).

7. La muteína de IL-11 de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC 15 ID NO:4, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:4, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:4, SEC ID NO:5,

aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:5, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:5, SEC ID NO:6, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:6, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:6, SEC ID NO:7, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:7, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:8, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:8, SEC ID NO:13, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:13, aminoácidos 10 a 175 de SEC 20 ID NO:13, y secuencias de aminoácidos que son al menos 85% idénticas a una cualquiera de las SEC ID NOs mencionadas anteriormente, en la que las secuencias de aminoácidos que son al menos 85% idénticas a una cualquiera de las SEC ID NOs mencionadas anteriormente muestran unión potenciada a la cadena alfa del receptor de IL-11.

8. La muteína de IL-11 de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC 25 ID NO:9, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:9, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:9, SEC ID NO:10,

aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:10, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:11, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:11, SEC ID NO:12, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:12, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:12, SEC ID NO:14, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:14, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:14, SEC ID NO:15, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:15, aminoácidos 10 a 30 175 de SEC ID NO:15, SEC ID NO:16, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:16, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID

NO: 16, SEC ID NO:17, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:17, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:17, SEC ID NO:18, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:18, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:18, SEC ID NO:19, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:19, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:19, SEC ID NO:20, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID NO:20, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:20, SEC ID NO:21, aminoácidos 10 a 178 de SEC ID 35 NO:21, aminoácidos 10 a 175 de SEC ID NO:21, y secuencias de aminoácidos que son al menos 85% idénticas a

una cualquiera de las SEC ID NOs mencionadas anteriormente, en la que las secuencias de aminoácidos que son al menos 85% idénticas a una cualquiera de las SEC ID NOs mencionadas anteriormente muestran unión potenciada a la cadena alfa del receptor de IL-11.

9. La muteína de IL-11 de la reivindicación 1 ó 7 u 8, en la que dicha muteína de IL-11 está PEGilada.

40 10. Una composición farmacéutica que comprende la muteína de IL-11 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

9, y uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

II. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 o la muteína de IL-11 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para el uso en un método para el tratamiento o profilaxis de una afección seleccionada del grupo de trombocitopenia, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, infertilidad, daño mucosal por

45 quimioterapia y/o terapia de radiación, cáncer de huesos metastáslco, mleloma, enfermedad de Paget del hueso y osteoporosis, y fertilidad.