Transferencia de materiales en células utilizando silicio poroso.
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E04030257.
Solicitante: PSIMEDICA LIMITED.
Nacionalidad solicitante: Reino Unido.
Dirección: MALVERN HILLS SCIENCE PARK, GERALDINE ROAD MALVERN, WORCESTERSHIRE, WR14 3SZ REINO UNIDO.
Inventor/es: CANHAM, LEIGH, TREVOR.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/87 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Introducción de material genético extraño utilizando procedimientos no previstos en otro lugar, p. ej. cotransformación.
- C12N15/89 C12N 15/00 […] › utilizando la micro-inyección.
PDF original: ES-2400472_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Transferencia de materiales en células utilizando silicio poroso.
Esta invención se relaciona con formas de transferencia de materiales en células.
Se presentan ocasiones en donde es necesario transferir materiales en células, por ejemplo ácidos nucleicos o construcciones de ácido nucleico, tales como vectores o plásmidos, etc. que se tienen que transferir en una célula para propósitos de manipulación genética. Adicionalmente, también se necesita que se transfieran productos químicos a las células, por ejemplo nucleótidos o manchas, y productos químicos que afectan la fisiología de una célula. Se han desarrollado una serie de procesos químicos y físicos para transportar materiales a las células. Estas técnicas incluyen:
1. microinyección directa - se inserta una aguja en una célula y el material se expele a través de la aguja;
2. electroporación - la membrana celular se hace permeable a algunas moléculas mediante aplicación de una descarga de alto voltaje;
3. biolística – las partículas de tungsteno u oro se recubren con la sustancia deseada que se va a introducir y se disparan en la célula;
4. co-precipitación de fosfato de calcio – las células absorben fosfato de calcio, y si se coprecipita ADN/otro material con el fosfato de calcio este también se toma en la célula;
5. transformación mediada (a través de liposomas, vectores víricos, o bacteriales) ; y
6. transformación de protoplasto.
Un objetivo de un aspecto de la presente invención es utilizar un nuevo material para ayudar en la transferencia de sustancias a las células.
La presente invención proporciona una forma mejorada para proporcionar pequeños volúmenes de una sustancia.
La microinyección directa implica la inserción mediante una microaguja de ADN directamente en el núcleo de células individuales. Se utiliza una micropipeta de vidrio unida a un micromanipulador para inyectar 10-8 - 10-7 µl de material, normalmente una solución de fragmentos de ADN, en los núcleos celulares. Los “impactos” casi con seguridad, son dados por la experticia del operador, pero la técnica es laboriosa y no se puede aplicar a un gran número de células.
La presente invención se define en y mediante las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con un primer aspecto la invención comprende un vehículo para transferir una sustancia dentro de la célula, el vehículo comprende una partícula de poro submicrónico o silicio policristalino y un material que se va a transferir en una célula y en donde el silicio es reabsorbible.
Preferiblemente se utiliza silicio poroso reabsorbible o bioerosionable.
El vehículo puede comprender, por lo menos en parte, silicio poroso, y el material que se va a transferir en la célula.
Preferiblemente el silicio poroso es reabsorbible. El vehículo puede comprender un proyectil biolístico de silicio poroso. El vehículo puede comprender una sustancia que en uso coprecipitará con una sustancia co-precipitada que se pone en la célula. El vehículo puede comprender un electrodo de silicio poroso eléctricamente conductor.
La invención permite el uso de silicio poroso como un medio de transferencia para transferir materiales en una célula viva.
Se ha descubierto que el silicio poroso es biocompatible, y ahora se ha descubierto que el silicio poroso se puede corroer en, o reabsorber en, un organismo mamífero sin efecto perjudicial significativo. Se puede utilizar silicio poroso para ubicar y sustancialmente inmovilizar materiales biológicos (o cualesquier sustancia que se introduzca en una célula) , con la sustancia que está suficientemente libre una vez en la célula para combinarse con el ADN celular,
o de otra forma ser liberado para que tenga un efecto.
De la Solicitud de Patente PCT No. WO 96/10630 se conoce una matriz de púas o puntas de silicio micromecanizadas que se utilizan mecánicamente para perforar la membrana de plasma de grandes series de células simultáneamente. Esto es más eficiente que perforar una sola célula con una única aguja, lo que puede resultar en una operación laboriosa si se necesita introducir material en cientos de células. Las puntas del documento WO 96/10630 son, en retrospectiva, menos efectivas en la transferencia de material (por ejemplo ADN) en una célula perforada de lo que podrían ser. Por ejemplo, se propone en ese documento utilizar fuerzas de tensión superficial entre las puntas poco distantes para sujetar el material biológico que se va a introducir en las células en los espacios entre las puntas, y atraparlo entre las puntas (sondas) y el sustrato.
En el documento US 5 262 128 se describe una propuesta que se publicó en 1993 y pretende enseñar al experto en la técnica a producir una matriz de agujas de silicio que utiliza los Procesos de Liga. Se considera que este documento no es favorable en su fecha de presentación (y publicación) . En 1989 cuando se presentó la solicitud, y en 1993 cuando se publicó, la persona medianamente versada en la técnica no podía producir agujas de silicio muy finas que tuvieran un lumen central como se discute en este documento que utiliza las técnicas discutidas. El Proceso de Liga no es adecuado para fabricar agujas huecas en silicio, y no permite que se realicen estructuras inclinadas.
El documento US 5 457 041 describe una matriz de agujas sólidas hechas de silicio que tienen puntas irregulares.
El documento US 5 591 139 describe una microaguja de silicio que se forma en el plano de una placa de silicio.
El documento WO 97/06101 describe un método para producir silicio bioactivo como una placa, y sugiere usos para el silicio bioactivo en la fabricación de biosensores y en bioensayos.
El documento WO 92/01802 describe la idea de poner una sustancia en una célula al incorporar la sustancia en un líquido y hacer las partículas del líquido, y luego acelerar las partículas de hielo para penetrar las células, las partículas de hielo se funden después de la penetración celular.
El documento JP 06 034 361 describe una punta microscópica de fuerza atómica de silicio poroso. El dispositivo no penetra la superficie que se va a examinar.
El documento US 4 969 468 describe agujas de metal sólidas para contacto eléctrico con nervios.
La invención puede comprender un elemento que penetra la célula hecho de silicio poroso.
El elemento que penetra la célula se puede adaptar para tener una sustancia que se va a introducir en una célula transportada por el silicio poroso.
La invención puede comprender un elemento que penetra la célula o un microperforador que comprende por lo menos una región de silicio poroso. Preferiblemente la sustancia comprende ADN o ARN, un fragmento de ADN o ARN, o una construcción de ADN o ARN.
El elemento que penetra la célula se adapta preferiblemente para que tenga una sustancia que se va a introducir a una célula transportada por el silicio.
La región de silicio poroso se adapta para inmovilizar una sustancia (por ejemplo ADN) en comparación con su movilidad cuando se proporciona con una sustancia bioinerte tal como titanio. La región de silicio poroso puede estar en la punta del elemento que penetra la célula. El elemento que penetra la célula puede tener una capilaridad o red de poro que se extiende desde un reservorio o canal hasta una región de suministro de sustancia proporcionada sobre la superficie del elemento que penetra la célula.
El elemento que penetra la célula puede tener un recubrimiento de silicio poroso, o puede ser poroso a lo largo de su sección transversal, por lo menos en su punta (u otra región de suministro de sustancia si esa no está en la punta) . Sustancialmente la superficie exterior entera del elemento que penetra la célula que penetra una célula en uso puede comprender silicio poroso. El elemento que penetra la célula puede ser una serie de micropuntas de silicio con un recubrimiento de silicio poroso.
Una ventaja de contener la sustancia que se va a introducir a la célula en la punta del elemento que penetra la célula es que el material se introduce de forma definitiva en la célula, y normalmente en lo profundo de la misma. Esto puede aumentar el índice de éxito de la operación (en muchos casos introducir ADN en células y la absorción estable del ADN/fragmento no es estadísticamente muy exitosa - un pequeño porcentaje puede tener éxito, es por eso que se tienen que inyectar muchas células) .
En lugar de utilizar silicio poroso para inmovilizar el material sobre la punta/asegurar por lo menos algo del material que está presente sobre la punta, se pueden utilizar otros medios de sujeción.... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un vehículo para transferir material en una célula, el vehículo comprende una partícula de poro submicrónico o silicio policristalino y un material que se va a transferir en una célula y en donde el silicio es reabsorbible.
2. Un vehículo de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la partícula submicrónica comprende una capa de silicio porosa.
3. Un vehículo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la partícula submicrónica comprende silicio bioactivo.
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