PROCEDIMIENTO PARA MODIFICAR GENETICAMENTE PLANTAS LEÑOSAS MEDIANTE LA UTILIZACION DE CELULAS CON CAPACIDAD MERISTEMATICA.

Procedimiento para modificar genéticamente plantas leñosas mediante la utilización de células con capacidad meristemática.

La presente invención se refiere a un procedimiento de transformación de plantas leñosas que comprende las siguientes etapas:

(i) selección de explantos a transformar,

(ii) eliminación de yemas presentes en los explantos,

(iii) transformación del material,

(iv) desarrollo de meristemos,

(v) selección de brotes transformados,

que se puede utilizar para la introducción de genes específicos que permitan incorporar caracteres interesantes a la planta transformada, tales como genes de resistencia a enfermedades, genes relacionados con la productividad, con la calidad de fruto, con sus propiedades organolépticas o nutritivas, con la tolerancia a sequía, salinidad u otros estreses, o cualquier otro carácter o caracteres de interés. En realidad cualquier gen, procedente de cualquier organismo, que sea susceptible de ser introducido mediante el procedimiento objeto dela presente invención y que pueda suponer una mejora de cualquier clase en el germoplasma existente

Procedimiento para modificar genéticamente plantas leñosas mediante la utilización de células con capacidad meristemática.

Sector de la técnica

La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la biotecnología agraria y forestal y en concreto se refiere a un procedimiento para la obtención de plantas leñosas modificadas genéticamente con elevada eficiencia.

Estado de la técnica

La obtención de nuevas variedades de plantas es una constante en la producción agraria debido a la demanda continua, tanto por parte de los productores como de los consumidores, de variedades que respondan a nuevas expectativas.

La obtención de estas nuevas variedades se puede hacer mediante mejora genética. Así, en la mayoría de las especies leñosas se han producido hasta el momento variedades mejoradas mediante mejora clásica y esta es, prácticamente, la única metodología disponible en muchas de estas especies en la actualidad. Sin embargo, la mejora genética clásica de plantas leñosas está limitada por sus largos periodos juveniles, una compleja biología reproductiva y un alto grado de heterozigosis, lo que implica, entre otras cosas, un número elevado de años entre generaciones y una elevada segregación de caracteres entre los descendientes de cruzamientos controlados.

Como alternativa a la mejora genética convencional se pueden utilizar procedimientos de transformación para mejorar plantas leñosas. El desarrollo y aplicación de este tipo de procedimientos es de gran interés, incluso mayor que en el caso de las plantas anuales, debido a que la mayoría de las variedades comerciales de especies leñosas se propagan vegetativamente y se puede producir una cantidad ilimitada de la línea transgénica deseada. Los procedimientos de transformación genética permiten la inserción de genes específicos en las variedades comerciales induciendo cambios deseables pero pequeños y discretos sin alterar el resto de caracteres agronómicos.

La producción de plantas anuales transgénicas se ha convertido en una realidad, habiendo pasado el área dedicada a cultivos transgénicos de 1.7 millones de hectáreas en 1996 a los 67.7 millones cultivadas en 2003, lo que supone un incremento de más de 40 veces (James, 2003). Sin embargo, en la actualidad, el único frutal transgénico que se está comercializando es la papaya resistente al virus de los anillos de la papaya (Para más información sobre plantas transgénicas comercializadas se puede consultar http://www.agbios.com/).

La transformación genética de plantas leñosas de interés agronómico tiene un enorme potencial en la obtención futura de variedades mejoradas. No obstante, para su utilización como herramienta de uso común en los programas de mejora es necesario el desarrollo de procedimientos de transformación que permitan introducir el material genético deseado y regenerar plantas completas a partir de las células transformadas de la variedad que se pretende mejorar. Ya que las plantas leñosas suelen ser recalcitrantes a producir regeneración adventicia a partir de tejidos adultos, este es el principal factor limitante de los procedimientos de transformación disponibles hasta el momento. Además es necesario que estos procedimientos utilicen material adulto, presenten elevada eficiencia, sean independientes del genotipo y fáciles de reproducir.

En la actualidad se han desarrollado algunos procedimientos para la transformación genética de frutales leñosos, incluyendo especies del género Prunus (Laimer da Cámara Machado et al., 1992; Miguel y Oliveira, 1999; Scorza et al., 1994; Scorza et al., 1995b; Smigocki y Hammerschlag, 1991) y otros géneros (Dandekar et al., 1998; Fitch et al., 1992), que utilizan material juvenil. En la mayoría de los casos este material procede de semillas con una dotación genética desconocida, lo que elimina la posibilidad de realizar cambios discretos y definidos en variedades comerciales con características agronómicas conocidas que es el principal interés de la transformación genética de leñosas. Una excepción son los cítricos, en los que sus semillas apomícticas permiten utilizar material juvenil con la dotación genética de la planta madre y esto ha permitido importantes avances en los últimos años (Domínguez et al., 2000; Fagoaga et al., 2001; Cervera et al., 2000; Peña et al., 2001). Sin embargo, debido a los largos periodos de juvenilidad, el desarrollo de procedimientos de transformación de material adulto sería muy conveniente. La transformación de tejido adulto de la variedad "Pineapple" de naranjo dulce produjo plantas que florecieron y fructificaron en 14 meses (Cervera et al., 1998), mientras que el naranjo dulce (del cual se produce aproximadamente un 70% de la producción total de cítricos en el mundo) necesita hasta 20 años para perder completamente los caracteres juveniles y entrar en producción (Peña y Navarro, 1999). Sin embargo, las eficiencias de transformación de material adulto de cítricos son mucho más bajas que con material juvenil. Por ejemplo, la eficiencia de transformación en la variedad "Pineapple" de naranjo dulce es un tercio de la obtenida con semillas nucleares de esta variedad (Cervera et al., 1998). Otros autores han obtenido resultados similares transformando material adulto con bajas eficiencias (Almeida et al., 2003). El Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) ha patentado un "Procedimiento de transformación genética de plantas adultas de especies leñosas" (ES 2 151 338) que pretende evitar el periodo juvenil y permitir la transformación genética directa de variedades de interés comercial (Cervera et al., 1998). Sin embargo, este procedimiento requiere que ocurra regeneración adventicia en los extremos de los entrenudos, lo que en muchos frutales simplemente no ocurre ni siquiera trabajando con material juvenil.

La regeneración adventicia es muy dependiente de numerosos factores, tales como el explanto utilizado, su estado fisiológico, su edad, el medio donde los explantos se mantienen antes de la transformación y por supuesto numerosos componentes del medio de regeneración (revisado en Burgos et al., 2007). La regeneración es también enormemente dependiente del genotipo utilizado y procedimientos desarrollados para una determinada variedad funcionan mal o no funcionan en absoluto con otras variedades de la misma especie (Petri y Burgos, 2005). Por lo tanto, ninguno de los procedimientos descritos resuelve el problema de la necesidad de un sistema de regeneración y transformación fácil de reproducir e independiente del genotipo, ambos requisitos necesarios para que los procedimientos de transformación de plantas se conviertan en una herramienta para la mejora de frutales.

El desarrollo de procedimientos de transformación independientes del genotipo será muy difícil de conseguir si estos se basan en la regeneración a través de procesos de organogénesis o embriogénesis adventicia. La organogenesis y embriogénesis implica la des-diferenciación de las células del explanto inicial (células de hoja, tallo, raíz, etc), hasta que adquieren otra vez capacidad meristemática y posteriormente se diferencian en un nuevo brote o en un embrión somático.

La necesidad de regeneración adventicia en la producción de plantas transgénicas podría ser eliminada mediante la transformación de meristemos, permitiendo la manipulación genética de variedades establecidas comercialmente. Sin embargo, es difícil trabajar con estructuras tan organizadas y son comunes los problemas de contaminación y de obtención de quimeras. Diferentes autores han intentado transformar meristemos obtenidos de plantas micropropagadas (Ye et al., 1994; Druart et al., 1998). Sin embargo, una elevada mortalidad de los explantos y dificultades en el control del crecimiento de Agrobacterium han limitado el desarrollo de esta metodología (Scorza et al., 1995a). Otra aproximación diferente consiste en generar un "agregado meristemático", un tejido producido a partir de brotes cultivados in vitro mediante tratamientos mecánicos (disección del meristemo apical) y químicos (incremento progresivo en la concentración de citoquinina) que eliminan la dominancia apical de los brotes y promueven la proliferación basal de meristemos (Mezzetti et al., 2002). Este agregado de tejido meristemático posee, en teoría, una elevada capacidad de regeneración y puede ser transformado eficientemente con Agrobacterium dado el gran número de células dividiéndose activamente. No obstante esta tecnología no...

1. Procedimiento de transformación de plantas leñosas caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

(i) Selección de explantos a transformar.

(ii) Eliminación de yemas presentes en los explantos.

(iii) Transformación del material, células con capacidad meristemática presentes en la base de las yemas.

(iv) Desarrollo de meristemos a partir de las células transformadas.

(v) Selección de brotes transformados.

(vi) Análisis del material transformado.

2. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación 1 caracterizado porque dicha selección de explantos a transformar (i) se realiza seleccionando explantos procedentes de fragmentos de tallos de brotes micropropagados que tengan al menos un nudo o zona donde se encuentre una yema axilar y el nacimiento de una hoja.

3. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicha selección de explantos a transformar (i) se realiza utilizando fragmentos de tallos micropropagados de entre 2 y 5 cm de longitud.

4. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación 1 caracterizado porque dicha eliminación de yemas (ii) presentes en los explantos se realiza deslizando un bisturí bien afilado paralelo al tallo.

5. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicha eliminación de yemas (ii) se realiza eliminando completamente la yema mediante un corte estricto pero sin profundizar en exceso de modo que queden células con capacidad meristemática en la base de la yema.

6. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque a continuación de dicha eliminación de yemas (ii) se preparan los explantos cortando el tallo en secciones entre 0,5 y 1 cm que contengan, al menos, un nudo donde previamente había una hoja.

7. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación 1 caracterizado porque dicha transformación de material (iii) se realiza por cualquier medio de transformación de plantas conocido como por ejemplo alguno de los comprendidos entre infección con Agrobacterium, medios balísticos, electroporación química o eléctrica, microinyección, utilizando liposomas, vectores fitopatógenos u otros medios que permitan la introducción de información genética en el material vegetal.

8. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación 1 caracterizado porque dicha transformación de material (iii) se realiza mediante infección con Agrobacterium tumefaciens.

9. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicha transformación de material (iii) se realiza mediante infección con una cepa de Agrobacterium tumefaciens no oncogénica.

10. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicha transformación (iii) con una cepa de Agrobacterium tumefaciens no oncogénica se realiza mediante infección a vacío con una presión de 760 mm de Hg y co-cultivo de los explantos con la bacteria.

11. Procedimiento de transformación de plantas según reivindicación 7 caracterizado porque dichos medios de transformación de plantas conocidos utilizados para dicha transformación de material vegetal (iii) contienen las construcciones genéticas portadoras de los genes de interés para la transformación y los elementos necesarios para su expresión y selección.

12. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación 1 caracterizado porque tras dicha transformación de material vegetal (iii) y antes del desarrollo de meristemos (iv) se realiza una etapa de co-cultivo (iiib) de los explantos con la bacteria durante un periodo comprendido entre 1 y 5 días en oscuridad y a una temperatura entre 22 y 26ºC.

13. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicho co-cultivo (iiib) de los explantos con la bacteria se realiza durante un periodo de 2 días en oscuridad.

14. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicho co-cultivo (iiib) de los explantos con la bacteria se realiza utilizando un medio adecuado para la inducción de la virulencia de la bacteria añadiendo acetosiringona (AS) entre 50 y 200 µM.

15. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicho co-cultivo (iiib) de los explantos con la bacteria se realiza utilizando un medio que contiene 100 µM de acetosiringona (AS).

16. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación 1 caracterizado porque dicho desarrollo de meristemos (iv) se realiza mediante el cultivo del material transformado en un medio adecuado para el desarrollo de meristemos caracterizado porque contiene los nutrientes necesarios y un balance elevado citoquininas/auxinas.

17. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicho desarrollo de meristemos (iv) se realiza mediante el cultivo del material en un medio adecuado que contiene los antibióticos necesarios para eliminar la bacteria utilizada en la transformación.

18. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicho desarrollo de meristemos (iv) se realiza mediante el cultivo del material en un medio adecuado que como antibióticos para eliminar la bacteria utilizada en la transformación contiene una combinación de cefotaxima y vancomicina.

19. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicha combinación de antibióticos contiene entre 200 y 400 mg/l de cefotaxima y entre 100 y 300 mg/l de vancomicina.

20. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según cualquiera de las reivindicaciones 18 o 19 caracterizado porque dicha combinación antibióticos contiene 300 mg/l de cefotaxima y 200 mg/l de vancomicina.

21. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación 1 caracterizado porque dicha selección de brotes transformados (v) se realiza mediante cultivo del material transformado en un medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20 suplementado con los agentes necesarios para la selección de los brotes transformados como por ejemplo antibióticos, marcadores de funciones metabólicas o cualquier otro tipo de agente de selección.

22. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicha selección de brotes transformados (v) mediante cultivo en el medio de desarrollo de meristemos suplementado con los agentes de selección necesarios se realiza durante un periodo de entre 1 y 4 semanas en oscuridad con una temperatura de entre 22 y 26ºC.

23. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicha selección de brotes transformados (v) se realiza durante un periodo de 2 semanas en oscuridad con una temperatura de entre 22 y 26ºC.

24. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicha selección de brotes transformados (v) se realiza durante un periodo de 2 semanas en oscuridad con una temperatura de 23ºC y una humedad relativa de 60%.

25. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 caracterizado porque tras dicha selección de brotes transformados (v) mediante cultivo en el medio de desarrollo de meristemos suplementado con los agentes de selección necesarios en oscuridad se someten a un fotoperiodo de entre 14 y 18 h de luz con una intensidad luminosa de entre 30 y 70 µEm^-2s^-1.

26. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque tras dicha selección de brotes transformados (v) éstos se someten a un fotoperiodo de 16 horas de luz con una intensidad luminosa de 50 µEm^-2s^-1.

27. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26 caracterizado porque dicha selección de brotes transformados (v) se realiza utilizando como medio de cultivo cualquier medio descrito que permita regenerar brotes transformados.

28. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque dicha selección de brotes transformados (v) se realiza utilizando un medio para regenerar brotes adventicios a partir de hojas

29. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 caracterizado porque tras dicha selección de brotes transformados (v), se procede al aislamiento de cada uno de ellos y se transfieren a un tubo de ensayo independiente donde se cultivan con el mismo medio utilizado en la selección de los brotes durante un periodo comprendido entre 2 y 4 semanas.

30. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque tras el aislamiento de los brotes, las yemas que han sido capaces de sobrevivir a la selección con el agente de selección correspondiente (como por ejemplo antibióticos, marcadores de funciones metabólicas o cualquier otro tipo de agente de selección) y formar un brote se transfieren a medio de proliferación con el agente de selección correspondiente durante un número de ciclos de cultivo comprendido entre uno y dos ciclos de entre 2 y 5 semanas cada uno.

31. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque tras el aislamiento de los brotes, las yemas que han sido capaces de sobrevivir a la selección con el agente y formar un brote se transfieren a medio de proliferación con el agente de selección correspondiente durante un número de ciclos de cultivo comprendido entre uno y dos ciclos de 3 semanas cada uno

32. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación 1 caracterizado porque dicho análisis del material vegetal transformado (vi) se realiza mediante el análisis de la presencia del gen o genes utilizados en la transformación o de cualquier gen marcador introducido.

33. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según reivindicación anterior caracterizado porque el análisis de la presencia del gen o genes utilizados en la transformación o de cualquier gen marcador introducido se realiza amplificándolo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos diseñados para la amplificación de dicho gen o genes.

34. Procedimiento de transformación de plantas leñosas según cualquiera de las reivindicaciones 32 o 33 caracterizado porque el análisis de la presencia del gen o genes utilizados en la transformación o de cualquier otro gen marcador introducido se realiza analizando su integración o su expresión.

35. Plantas leñosas modificadas genéticamente mediante transformación por el procedimiento descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34.

36. Plantas leñosas modificadas genéticamente según reivindicación anterior comprendidas entre cualquier especie del género Prunus u otras especies leñosas.

37. Plantas leñosas modificadas genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 35 o 36, resistentes a virus, tolerantes a salinidad o sequía, o a cualquier otro tipo de estrés biótico o abiótico, que expresen caracteres de incremento de productividad, de calidad de fruto, de mejora de cualidades organolépticas, nutritivas o que expresen cualquier otro carácter o caracteres de interés.

38. Uso del procedimiento de transformación de plantas leñosas descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 para la transformación de plantas hortícolas que se puedan propagar mediante el desarrollo de yemas axilares.

39. Uso del procedimiento de transformación de plantas leñosas descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, para la introducción de cualquier tipo de información o carácter genético en plantas frutales y forestales.

40. Plantas capaces de propagarse mediante el desarrollo de yemas axilares transformadas genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 38 o 39.

41. Plantas capaces de propagarse mediante el desarrollo E de yemas axilares transformadas genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 38 o 39 resistentes a virus, tolerantes a salinidad o sequía, o a cualquier otro tipo de estrés biótico o abiótico, que expresen caracteres de incremento de productividad, de calidad de fruto, de mejora de cualidades organolépticas, nutritivas o que expresen cualquier otro carácter o caracteres de interés.