Un procedimiento in vitro para transfectar una célula que comprende la etapa de poner un complejo que comprende

(i) uno o más vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico;

y

(ii) una o más partículas magnéticas que se acoplan con uno o más oligo- o policationes u oligo- o polianiones en contacto con una célula aplicando un campo magnético adecuado, en el que dicha(s) partícula(s) magnética(s) y dicho(s) vector(es) se ensamblan en el complejo por agregación inducida por sal.

Procedimiento para transfectar células usando un campo magnético.

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para transfectar una célula que comprende poner en contacto con una célula un complejo que comprende vector (es) que comprende (n) una o más moléculas de ácido nucleico y partícula (s) magnética (s) que están acopladas con uno o más oligo- o policationes u oligo- o polianiones mediante la aplicación de un campo magnético en el que dicha (s) partícula (s) magnética (s) y dicho (s) vector (es) se ensamblan en el complejo por agregación inducida por sal. La presente invención se refiere además a un complejo de este tipo, así como a procedimientos para prepararlo. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas, usos y un kit.

La viabilidad del tratamiento génico depende en última instancia de la disponibilidad de vectores génicos eficaces. Los vectores génicos son vehículos usados para transportar una información genética deseada codificada por un ácido nucleico (ADN o ARN) a una célula diana y para que se exprese en ella. Los virus han desarrollado soluciones extraordinarias para este problema de transferencia génica. En consecuencia, los virus modificados genéticamente (recombinantes) se encuentran entre los vehículos más eficaces conocidos actualmente para la transferencia de información genética a células. Se han diseñado una multitud de especies víricas como vectores génicos, incluidos retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes simplex, virus de hepatitis, virus vaccinia y lentivirus. En general, se elimina la información genética necesaria para el ciclo de duplicación natural de los virus del genoma vírico y se reemplaza con el/los gen (es) de interés que se supone que ejerce (n) algún efecto terapéutico en el caso de aplicaciones de tratamiento génico. Más recientemente, también se han usado virus capaces de duplicarse como vehículos de transferencia génica.

Como alternativa a los vectores génicos víricos, se han desarrollado vehículos para transferencia génica no víricos, sintéticos y semisintéticos durante la última década. La mayoría de estos vectores no víricos imitan características importantes de la entrada celular vírica para superar las barreras celulares frente a la infiltración de material genético exógeno. Entre estas barreras se encuentran la membrana plasmática, las membranas de las vesículas internas tales como endosomas y lisosomas y las membranas nucleares. Entre las funciones víricas imitadas en vectores no víricos están la capacidad de dirigirse a receptores, de unirse a ADN y de compactarse y de liberación intracelular desde vesículas internas. Estas funciones individuales están representadas en módulos sintéticos o semisintéticos que habitualmente se ensamblan mediante interacciones electrostáticas y/o hidrófobas para formar una partícula de vector. Con el fin de clasificar sistemáticamente los vectores génicos no víricos en función de su composición modular, se ha propuesto la nomenclatura siguiente (Feigner et al. 1997) : Los lipoplexos son conjuntos de ácidos nucleicos con un componente lipídico, que habitualmente es catiónico. La transferencia génica por lipoplexos se llama lipofección. Los poliplexos son conjuntos de ácidos nucleicos con una entidad oligo- o policatiónica. Los complejos de ADN que comprenden ambas clasificaciones se llaman lipo-poliplexos o poli-lipoplexos. Se han descrito una gran variedad de combinaciones de este concepto general. Los ejemplos incluyen los complejos clásicos de lípido catiónico-ADN (Feigner y Ringold 1989) , complejos de policatión-ADN tales como poli (lisina) -ADN (Wu y Wu 1987) , poli (etilenimina) -ADN (Boussif et al. 1995) , dendrímero de poli (amidoamina) -ADN (Haensler y Szoka 1993) , complejos de péptido catiónico-ADN (Planck et al. 1999) , complejos de proteína catiónica-ADN (histonas, proteínas HMG) (Zenke et al. 1990) . Frecuentemente, tales complejos de ADN se modifican adicionalmente para que contengan un resto marcador de células o marcador intracelular y/o un componente desestabilizador de la membrana tal como un virus inactivado (Curiel et al. 1991) , una cápsida vírica o una proteína

o péptido vírico (Fender et al. 1997; Zhang et al. 1999) o un péptido sintético que altera la membrana (Wagner et al. 1992; Plank et al. 1994) . Asimismo, se ha incluido el ácido nucleico que ha de transportarse en el lumen acuoso de liposomas (Nicolau y Cudd 1989) , o se asocia el ADN condensado con policationes con una membrana lipídica (Gao y Huang 1996; Li et al. 1998) . También se ha compuesto la membrana lipídica para que sea una quimera de membranas naturales derivadas de virus o células que contienen proteínas de membrana (por ejemplo, liposomas HVJ (Kaneda 1998) ]) . Recientemente, también se han descrito bacterias (GrillotCourvalin et al. 1998) y fagos (Poul y Marks 1999) como lanzaderas para la transferencia de ácidos nucleicos a células. Aparte de estas composiciones de vector sofisticadas, también se sabe que el ADN desnudo es un agente de transfección útil en determinadas aplicaciones (Wolff et al. 1990) . La precipitación de ADN con cationes divalentes se ha usado con éxito para la transfección de líneas celulares cultivadas durante más de 10 años (precipitación con fosfato de calcio (Chen y Okayama 1988) ]) . Más recientemente, se ha descubierto que los protocolos de precipitación con fosfato de calcio también son útiles para potenciar la transferencia génica mediada por vectores tanto víricos como no víricos (Fasbender et al. 1998) .

También pueden formularse vectores o ADN desnudo para lograr un efecto de liberación sostenida o liberación controlada. Con este propósito, pueden inmovilizarse ADN o vectores sobre/en o asociarse con materiales transportadores tales como colágeno (Bonadio et al. 1998) , gelatina (Truong-Le et al. 1999) o adhesivo de fibrina. Asimismo, pueden incorporarse ADN o vectores en formulaciones de micro-y nanopartículas tales como en copolímeros como poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) (Shea et al. 1999) y composiciones similares o en nanopartículas preparadas a partir de quitosano (Roy et al. 1999) .

Independientemente de lo eficaz que sea cualquiera de los procedimientos de transferencia génica en las aplicaciones seleccionadas, todos ellos padecen graves limitaciones en cuanto a su aplicabilidad general en el tratamiento génico. Entre tales limitaciones, son llamativas las siguientes, en particular para tratamiento génico in vivo:

1. Especificidad de diana

a) En un extremo, posibilidad limitada de dirigir los vectores a células/órganos dianadebido a la falta de un tropismo de célula dianadiana específico y, como consecuencia, diseminación sistémica del vector, biodisponibilidad limitada en el sitio diana y la posibilidad de transfección inespecífica de células/órganos que no son diana.

b) En el otro extremo, un tropismo del huésped muy específico, que limita la posibilidad de aplicación de un vector a un espectro de dianas más amplio. Este problema prevalece para vectores víricos, en administración génica tanto ex como in vivo.

2. Inactivación rápida de vectores debida a interacciones no deseadas con componentes del medio in vivo antes de que el vector pueda encontrar su sitio diana. Ejemplos de interacciones no deseadas son la opsonización de vectores no víricos (Ogris et al. 1999) o interacciones de vectores con sistemas de defensa de los huéspedes tales como el sistema de complemento (Planck et al. 1996) o el sistema inmunitario (Kass-Eisler et al. 1996) .

3. Concentración de vectores insuficiente en el sitio diana (Luo y Saltzman 2000) .

Se han proporcionado soluciones parciales a estos problemas. Los tropismos de huéspedes de vectores víricos se han ampliado, reducido o redirigido mediante ingeniería genética de proteínas de superficie concretas que actúan como ligandos para receptores celulares (Kasahara et al. 1994; Michael et al. 1995) , mediante el acoplamiento de ligandos dirigidos a superficies víricas (Curiel 1999) , mediante coprecipitación de virus con fosfato de calcio (Fasbender et al. 1998) o mediante interacción electrostática con una molécula de unión a células inespecífica tal como un policatión (Fasbender et al. 1997) . Las interacciones no deseadas con componentes del medio in vivo se reducen mediante la modificación del vector con moléculas tales como poli (etilenglicol) (O'Riordan et al. 1999; Ogris et al. 1999; Romanczuk et al. 1999; Finsinger et al.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro para transfectar una célula que comprende la etapa de poner un complejo que comprende

(i) uno o más vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico; y

(ii) una o más partículas magnéticas que se acoplan con uno o más oligo- o policationes u oligo- o polianiones

en contacto con una célula aplicando un campo magnético adecuado, en el que dicha (s) partícula (s) magnética (s) y dicho (s) vector (es) se ensamblan en el complejo por agregación inducida por sal.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichas partículas magnéticas tienen un tamaño de hasta 2000 nm.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dichas partículas magnéticas se acoplan con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en poli (etilenimina) (PEI) , PEI-estreptavidina, PEI-biotina, almidón-fosfato, ácido poliaspártico, ácido poliacrílico, ácido poliacrílico-co-maleico, ácido arabínico, PEI-etoxilada, PEI-epiclorhidrina y PEIdodecilsulfato sódico.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho campo magnético es un campo permanente o un campo electromagnético.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho campo electromagnético oscila.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la célula se transfecta en un ensayo de alto rendimiento.

7. Un procedimiento para la preparación de un complejo útil para transfectar una célula, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de enlazar uno o más vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico y una o más partículas magnéticas que se acoplan con uno o más oligo- o policationes u oligo- o polianiones, en el que los componentes de dicho complejo se ensamblan por agregación inducida por sal.

8. Un complejo útil para transfectar una célula que comprende

(i) uno o más vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico; y

(ii) una o más partículas magnéticas que se acoplan con uno o más oligo- o policationes u oligo- o polianiones,

en el que dicha (s) partícula (s) magnética (s) y dicho (s) vector (es) se ensamblan en el complejo por agregación inducida por sal.

9. El complejo de la reivindicación 9, en el que dichas partículas magnéticas tienen un tamaño de hasta 2000 nm.

10. El complejo de la reivindicación 8 o 9, en el que dichas partículas magnéticas se acoplan con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en poli (etilenimina) (PEI) , PEI-estreptavidina, PEI-biotina, almidón-fosfato, ácido poliaspártico, ácido poliacrílico, ácido poliacrílico-co-maleico, ácido arabínico, PEI-etoxilada, PEI-epiclorhidrina y PEIdodecilsulfato sódico.

11. Una composición farmacéutica que comprende el complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 y, opcionalmente, un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

12. Uso del complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, el tratamiento o la vacunación contra una enfermedad por medio de la administración de un vector terapéuticamente útil que comprende una o más moléculas de ácido nucleico a un sujeto, implicando dicha prevención, tratamiento o vacunación la transfección de células con el/los vector (es) presente (s) en dicho complejo por medio de la aplicación de un campo magnético adecuado.

13. El complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para su uso en un procedimiento de prevención, tratamiento o vacunación contra una enfermedad por medio de la administración de un vector terapéuticamente útil que comprende una o más moléculas de ácido nucleico a un sujeto, implicando dicha prevención, tratamiento o vacunación la transfección de células con el/los vector (es) presente (s) en dicho complejo por medio de la aplicación de un campo magnético adecuado.

14. Uso del complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para transfectar una célula in vitro, en el que se pone en contacto el complejo con una célula mediante la aplicación de un campo magnético adecuado.

15. Uso del complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para transfectar células in vitro en un ensayo de alto rendimiento en el que se pone en contacto el complejo con una célula mediante la aplicación de un campo magnético adecuado.

16. Un kit que comprende

(i) el complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 y

(ii) opcionalmente, partículas magnéticas y/o vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico y/o componentes de vector adecuados para incorporar una molécula de ácido nucleico que se quiere expresar e instrucciones para la aplicación de un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y

(iii) opcionalmente, células y/o adyuvantes de tratamiento génico y/o uno o más imanes permanentes útiles para aplicar el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

Fig.

2. A1 GenePorter 10 min.

Fig.

2. A2 GenePorter 4h.

Fig. 23A Tabla

Fig.

2. A1 Lipofectamine 10 min.

Fig.

2. A2 Lipofectamine 4 h.

Fig. 24A Tabla

DOCHOL 10 min.

Fig. 25A Tabla