Sistema de producción de moléculas aromáticas en Streptomyces.

Procedimiento de producción de ácido ferúlico, alcohol coniferílico y/o vainillina naturales,

que comprende la bioconversión de eugenol por una bacteria perteneciente al género Streptomyces que comprende al menos une secuencia nucleotídica SEQ ID NO :1 o SEQ ID NO :8 o cualquier secuencia nucleotídica que sea al menos 70%, preferiblemente 80%, más preferiblemente 90% idéntica a la secuencia SEQ ID NO :1 o cualquier secuencia que sea al menos 80%, preferiblemente 90% idéntica a la SEQ ID NO :8.

Sistema de producción de moléculas aromáticas en Streptomyces.

La presente invención se refiere a la producción de moléculas aromáticas naturales. Más particularmente, la presente invención se refiere a la bioconversión en una bacteria de sustratos, preferiblemente eugenol, en derivados fenólicos principalmente alcohol coniferílico y ácido ferúlico, utilizándose dichos derivados para la producción de vainillina natural empleada en aromaticidad alimentaria o en perfumería (aromas o fragancias) .

La vainillina (3-metoxi-4-hidroxibenzaldehído) es el componente principal responsable de las propiedades olfativas y gustativas del extracto de vainilla derivado de vainas de Vanillia planifolia. Se trata de una de las moléculas aromáticas más utilizadas en la industria. Sin embargo, la producción de vainillina natural a partir de vaina de vainilla o de extracto de vainilla no cubre más que el 20% de este mercado; su utilización está limitada debido por una parte al potencial de vainas disponibles a nivel mundial y por otra al elevado precio, muy fluctuante, de estas vainas (del

orden de 30 ?/kg a 450 ?/kg es decir como mínimo 1500 ?/kg de potencial en vainillina natural) .

La vainillina de síntesis es por consiguiente utilizada frecuentemente como un sustituyente barato (aproximadamente ?/kg) de la vainillina natural para aplicaciones en perfumería, en cosmética y en las industrias agroalimentarias.

Los aromas de síntesis son sin embargo menos apreciados por los consumidores que los aromas naturales.

Este es el motivo por el que se busca obtener moléculas aromáticas naturales, en particular la vainillina, por procedimientos biológicos, principalmente de bioconversión, que utilizan microorganismos tales como bacterias.

En el sentido de la presente invención, se entiende por bioconversión la transformación biológica de un sustrato, preferiblemente procedente de una fuente natural, para obtener aromas, fragancias o precursores de aromas o de fragancias naturales.

La vainillina se puede producir según el esquema de reacción siguiente:

En la técnica anterior ya se han descrito varios procedimientos de producción de moléculas naturales, tal como la vainillina.

Principalmente, la patente EP 0885968 describe un procedimiento de producción de vainillina en una bacteria que pertenece al género Streptomyces. Este procedimiento comprende: a) el cultivo en un medio apropiado de una bacteria perteneciente al género Streptomyces de manera que se forme un caldo de fermentación, b) la adición a dicho caldo de 5 a 40 g/L de ácido ferúlico, de forma que se produzca la vainillina, y c) la extracción de la vainillina y del guayacol que se producen.

Otro ejemplo descrito en el artículo de J. Overhage et al., divulga: 1) la expresión del gen de la vainillil-alcoholoxidasa en Escherichia coli y 2) la expresión de los genes calA (que codifica la coniferil-alcohol-deshidrogenasa) y calB (que codifica la coniferil-aldehído-deshidrogenasa) . Este procedimiento permitiría la producción de ácido ferúlico como producto principal de la conversión de eugenol por la cepa recombinante final E. coli XL1 Blue (pSKvaom-PcalAmcalB) (Highly efficient biotransformation of eugenol to ferulic acid and further conversion to vanillin in recombinant strains of Escherichia coli, 2003, Applied and Environmental Microbiology pp. 6569-6576) . Se indica que el ácido ferúlico producido por esta cepa podría servir de sustrato a una segunda cepa multi-recombinada E. coli (pSKechE/Hfcs) para producir vainillina natural (J. Overhage ey al., Appl. Env. Microbiol. 65: 4837-4847, 1999)

El documento WO 2007/099230 describe un procedimiento de producción de ácido ferúlico, alcohol coniferúlico y/o vainillina naturales a partir de eugenol en levadura pero no hace ninguna mención del género Streptomycetaceae como hospedante potencial para la expresión heteróloga del gen vao.

El documento WO 01/55342 describe diferentes secuencias de ácidos nucleicos de síntesis, optimizadas para aumentar su expresión en un sistema heterólogo. Más particularmente, este documento describe la secuencia sintética del gen vaoA (SEQ ID N°67 página 30, líneas 33-38) que además es idéntica en un 84% a la secuencia optimizada SEQ ID N°1 y en un 78% a la secuencia optimizada SEQ ID N°8 considerada en toda su longitud. Sin embargo, en este documento, los genes sintéticos se obtienen con el fin de una mayor expresión en las bacterias entéricas (entre ellas E. coli) pero no en Streptomycetaceae.

Un último ejemplo de producción de derivados fenólicos a partir de eugenol está descrito en el artículo «Harnessing eugenol as a substrate for production of aromatic compounds with recombinant strains of Amycolatopsis sp HR167»

(J. Biotechnol. 2006 Sep 18;125 (3) :369-76. Epub 2006 May 4. Overhage J, Steinbuchel A, Priefert H.) . Este artículo describe la expresión del gen de la vainillil-alcohol-oxidasa en la cepa Amycolatopsis sp HR167, permitiendo catalizar la conversión de eugenol en alcohol coniferílico, aldehído coniferílico, ácido ferúlico, guayacol y ácido vainillínico. Estos tres ejemplos de producción de precursores de vainillina natural o de vainillina natural propiamente dicha presentan el inconveniente en primer lugar de tener un coste de producción relativamente elevado debido a la utilización de ácido ferúlico purificado que es una materia prima cara y por otro lado ser difíciles de realizar industrialmente debido a: 1) la utilización de cepas multi-recombinadas no alimentarias; y 2) el bajo rendimiento de las bioconversiones.

Para que un procedimiento biológico que emplea microorganismos pueda ser rentable, es preferible utilizar un sustrato muy disponible y barato y un microorganismo inofensivo y genéticamente estable. Los inventores han buscado también poner a punto un procedimiento de producción de precursores de vainillina natural o vainillina natural propiamente dicha, que sea sencillo de realizar industrialmente, es decir que no conste preferiblemente más que de una sola etapa y cuyo coste de producción sea menor que el de la técnica anterior. La solución propuesta por la invención es utilizar un sustrato natural disponible y de bajo coste que es eugenol así como una cepa de clase 1 que pertenezca al género Streptomyces, tal como por ejemplo Streptomyces griseus.

Así, la presente invención tiene por objeto un procedimiento de fabricación de vainillina o de precursores de vainillina tales como ácido ferúlico o alcohol coniferílico, o incluso una mezcla que contenga los precursores de vainillina y la vainillina, por bioconversión de eugenol, en una bacteria perteneciente al género Streptomyces, tal como se define en la reivindicación 1. En un primer modo de realización, el procedimiento de la invención permite fabricar vainillina. En un segundo modo de realización, el procedimiento de la invención permite fabricar ácido ferúlico. En un tercer modo de realización, el procedimiento de la invención permite fabricar alcohol coniferílico. En un cuarto modo de realización, el procedimiento de la invención permite fabricar una mezcla de alcohol coniferílico, ácido ferúlico y/o vainillina.

El procedimiento de la invención se realiza con ayuda de una bacteria perteneciente al género Streptomyces que comprende la secuencia SEQ ID NO :1 o la secuencia SEQ ID NO :8 o cualquier secuencia nucleotídica que sea al menos 70%, preferiblemente 80%, más preferiblemente 90% idéntica a la secuencia SEQ ID NO :1 o cualquier secuencia que sea al menos 80%, preferiblemente 90% idéntica a la secuencia SEQ ID NO :8. Las secuencias SEQ ID NO :1 y SEQ ID NO :8 corresponden al gen de la vainillil-alcohol-oxidasa presente en el genoma del hongo filamentoso Penicillium simplicissimum, habiendo sido optimizado dicho gen para ser leído en una bacteria perteneciente al género Streptomyces.

La presente invención tiene por consiguiente la ventaja de permitir la producción en una sola etapa, por medio de un catalizador biológico, de vainillina natural, alcohol coniferílico y/o ácido ferúlico naturales, esencialmente desprovistos de impurezas y a bajo precio.

Otro objeto de la invención es una bacteria perteneciente al género Streptomyces que comprende al menos une secuencia nucleotídica SEQ ID NO :1 o SEQ ID NO 8 o cualquier secuencia nucleotídica que sea al menos 70%, preferiblemente 80%, más preferiblemente 90% idéntica a la secuencia SEQ ID NO :1 o cualquier secuencia que sea al menos 80%, preferiblemente 90% idéntica a la secuencia SEQ ID NO :8.

Preferiblemente, la bacteria es Streptomyces griseus.

Otro objeto de la invención es la secuencia nucleotídica SEQ ID NO :1 y la secuencia SEQ... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de producción de ácido ferúlico, alcohol coniferílico y/o vainillina naturales, que comprende la bioconversión de eugenol por una bacteria perteneciente al género Streptomyces que comprende al menos une secuencia nucleotídica SEQ ID NO :1 o SEQ ID NO :8 o cualquier secuencia nucleotídica que sea al menos 70%, preferiblemente 80%, más preferiblemente 90% idéntica a la secuencia SEQ ID NO :1 o cualquier secuencia que sea al menos 80%, preferiblemente 90% idéntica a la SEQ ID NO :8.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende:

1) el cultivo de una bacteria perteneciente al género Streptomyces que comprende al menos una secuencia nucleotídica SEQ ID NO :1 o SEQ ID NO :8 o cualquier secuencia nucleotídica que sea al menos 70%, preferiblemente 80%, más preferiblemente 90% idéntica a la secuencia SEQ ID NO :1 o cualquier secuencia que sea al menos 80%, preferiblemente 90% idéntica a la SEQ ID NO :8,

2) la adición continua o en una sola dosis de eugenol como sustrato de bioconversión al medio de fermentación en una cantidad comprendida entre 5 y 50 g/L, preferiblemente 10 a 35 g/L, y

3) la extracción de la vainillina del medio de fermentación.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende:

1) el cultivo de una bacteria perteneciente al género Streptomyces que comprende al menos una secuencia nucleotídica SEQ ID NO :1 o SEQ ID NO :8 o cualquier secuencia nucleotídica que sea al menos 70%, preferiblemente 80%, más preferiblemente 90% idéntica a la secuencia SEQ ID NO :1 o cualquier secuencia que sea al menos 80%, preferiblemente 90% idéntica a la SEQ ID NO :8,

2) la adición en una sola dosis de eugenol como sustrato de bioconversión al medio de fermentación en una cantidad comprendida entre 5 y 40 g/L, preferiblemente 10 a 35 g/L, y

3) la extracción de alcohol coniferílico del medio de fermentación.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende:

1) el cultivo de una bacteria perteneciente al género Streptomyces que comprende al menos una secuencia nucleotídica SEQ ID NO :1 o SEQ ID NO :8 o cualquier secuencia nucleotídica que sea al menos 70%, preferiblemente 80%, más preferiblemente 90% idéntica a la secuencia SEQ ID NO :1 o cualquier secuencia que sea al menos 80%, preferiblemente 90% idéntica a la SEQ ID NO :8,

2) la adición continua de eugenol como sustrato de bioconversión al medio de fermentación en una cantidad comprendida entre 5 y 30 g/L, preferiblemente 10 a 25 g/L, y

3) la extracción de ácido ferúlico del medio de fermentación.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha bacteria se incuba en un medio cuyo pH es inferior a 10.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha bacteria se incuba a una temperatura comprendida entre 27 y 40°C, preferiblemente igual a 37°C.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha bacteria se obtiene por:

a) clonación de la secuencia nucleotídica SEQ ID NO :1 o SEQ ID NO :8 en un vector de expresión, preferiblemente específico de las bacterias pertenecientes al género Streptomyces,

b) transformación del vector de expresión obtenido en a) en una bacteria competente, preferiblemente E. coli DH5α,

c) transferencia del vector de expresión que comprende la secuencia SEQ ID NO :°1 o SEQ ID NO : 8 a E. coli ET12567,

d) transformación o conjugación de una bacteria perteneciente al género Streptomyces con la bacteria obtenida en c) , y

e) selección de las mejores bacterias transformantes obtenidas en d) en presencia del sustrato eugenol.

8. Bacteria perteneciente al género Streptomyces que comprende al menos une secuencia nucleotídica SEQ ID

NO :1 o SEQ ID NO : 8 o cualquier secuencia nucleotídica que sea al menos 70%, preferiblemente 80%, más preferiblemente 90% idéntica a la secuencia SEQ ID NO :1 o cualquier secuencia que sea al menos 80%, preferiblemente 90% idéntica a la SEQ ID NO :8.

9. Bacteria según la reivindicación 8, que es preferentemente Streptomyces griseus.

10. Secuencia nucleotídica SEQ ID NO :1.

11. Secuencia nucleotídica SEQ ID NO :8.

12. Vector de expresión que comprende al menos une secuencia SEQ ID NO :1 o SEQ ID NO :8.

13. Vector según la reivindicación 11, caracterizado porque es un vector bifuncional específico de las bacterias perteneciente al género Streptomyces.

14. Vector según la reivindicación 12, caracterizado porque se elige entre un vector integrador o un vector replicable de tipo multicopia.

15. Vector según la reivindicación 13, caracterizado porque se elige entre pFLA2 y pFLA3.

16. Vector según la reivindicación 13, caracterizado porque es el vector pFLA4.

17. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se produce vainillina, ácido ferúlico o alcohol coniferílico en 15 una cantidad de 10 a 25 g/L.

18. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la conversión del ácido ferúlico en vainillina se efectúa en la misma bacteria perteneciente al género Streptomyces o se efectúa por vía bioquímica o enzimática.