Sistema de expresión en eucariotas inducible.

Un procedimiento de inducción de la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés en una célulaeucariota,

que comprende:

(a) proporcionar una célula eucariota que comprende

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión reguladora (RPR),en la que la proteína de fusión consiste en

(1) un dominio de bloqueo de la transcripción bacteriano o de bacteriófago que puede inhibir laexpresión de la secuencia de nucleótidos de interés, y

(2) un dominio de unión a ligando que comprende un dominio de unión a ligando de receptor deestrógeno humano que tiene las mutaciones G400V, M543A y L544A, que se une tamoxifeno;

(ii) un promotor operativamente ligado a la secuencia de nucleótidos de interés y controlado por unoperador bacteriano o de bacteriófago que puede unirse al dominio de bloqueo de la transcripciónbacteriano o de bacteriófago y bloquear la transcripción del promotor;

(b) cultivar la célula de la etapa (a) a una densidad deseada en presencia de tamoxifeno que se une el dominiode unión a ligando de la proteína de fusión, inhibiéndose la expresión de la secuencia de nucleótidos deinterés; y

(c) eliminar el tamoxifeno de la presencia de la célula, induciéndose la expresión de la secuencia denucleótidos de interés.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos para la expresión inducible de genes en células eucariotas. La invención incluye adicionalmente células capaces de expresión génica inducible, animales transgénicos que comprenden tales células y secuencias de nucleótidos y proteínas que comprenden proteínas de fusión reguladoras.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En la técnica se conocen diversos procedimientos para la expresión controlada de una secuencia de nucleótidos recombinante de interés en una célula. Por ejemplo, No y col. (1996) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93:3346-3351, describen un sistema de expresión génico inducible que utiliza un transactivador quimérico que consiste en el receptor nuclear de ecdisona fusionado con el dominio de transactivación de VP16. En presencia del inductor, este transactivador quimérico se une a secuencias de reconocimiento en la dirección 5' de un promotor y estimula la transcripción de una secuencia de nucleótidos de interés. En ausencia del inductor, la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés se reduce y es dependiente del nivel basal de transcripción de la secuencia de nucleótidos del promotor de interés. Gossen y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, describen un sistema para regular la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés basada en una proteína quimérica, tTA, que consiste en la proteína represora TetR fusionada con el dominio de transactivación de VP16. Similar al sistema de ecdisona, las secuencias de ADN que especifican el sitio de unión a ADN de TetR se insertan en la dirección 5' del gen promotor de forma que la unión de la proteína de fusión TetR-VP16 estimule la transcripción del promotor y la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés. También se han desarrollado otros sistemas elegidos como diana para sitios de unión a ADN específicos proximales a un promotor mínimo para la regulación elegida como diana de la transcripción que utiliza el dominio de transactivación de VP16, que incluyen GAL4-VP16 (Sadowski y col. (1988) Nature 335:563-564) , LexA-VP16 (Brent y col. (1985) Cell 40:729-736) y LaeI-VP16 (Labow y col. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3342-3356) . Otros sistemas basados en TetR se describen en Deuschle y col. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:1907-1914 y Yao y col. (1998) Hum. Gene Ther. 13:1939-1950. El documento WO01/30843 desvela proteínas de fusión como reguladores dependientes de ligando en células eucariotas.

Los problemas resultantes de la expresión defectuosa relacionada con el uso de un promotor mínimo han conducido a sistemas que usan fusiones de los dominios de unión a esteroide de los receptores nucleares de glucocorticoides o estrógenos (véanse, por ejemplo, Mattioni y col. (1994) Methods Cell Biol. 43:335-352; Louvion y col. (1993) Gene 131:129-134; Iida y col. (1996) J. Virol. 70: 6054-6059.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un sistema de expresión génico inducible estrechamente regulado adecuado para la producción a gran escala de una molécula recombinante de interés en una célula eucariota. Los componentes del sistema de la presente invención incluyen una proteína de fusión que tiene un dominio de bloqueo de la transcripción y un dominio de unión a ligando; un operador que se une al dominio de bloqueo de la transcripción de la proteína de fusión para inhibir la transcripción de una secuencia de nucleótidos; y un promotor que está bajo el control del operador. Si se desea inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés, el sistema incluye un ligando que puede unirse al dominio de unión a ligando de la proteína de fusión, de forma que la proteína de fusión se estabiliza. Si se desea que la secuencia de nucleótidos de interés se exprese, el ligando se elimina, que produce desestabilización y degradación de la proteína de fusión. Por consiguiente, en ausencia del ligando relacionado, la proteína de fusión se elimina del operador, y la inhibición del operador del promotor que controla la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés se elimina, permitiendo así que se exprese la secuencia de nucleótidos de interés.

La invención proporciona un procedimiento de inducción de la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés en una célula eucariota, que comprende:

(a) proporcionar una célula eucariota que comprende

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión reguladora (RPR) , en la que la proteína de fusión consiste en

(1) un dominio de bloqueo de la transcripción bacteriano o de bacteriófago que puede inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés, y

(2) un dominio de unión a ligando que comprende un dominio de unión a ligando de receptor de estrógeno humano que tiene las mutaciones G400V, M543A y L544A, que se une tamoxifeno;

(ii) un promotor operativamente ligado a la secuencia de nucleótidos de interés y controlado por un

operador bacteriano o de bacteriófago que puede unirse al dominio de bloqueo de la transcripción bacteriano o de bacteriófago y bloquear la transcripción del promotor;

(b) cultivar la célula de etapa (a) a una densidad deseada en presencia de tamoxifeno que se une al dominio de unión a ligando de la proteína de fusión, inhibiéndose la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés; y

(c) eliminar el tamoxifeno de la presencia de la célula, induciéndose la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés.

La invención también proporciona una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una proteína de fusión reguladora, en la que la proteína de fusión consiste en

(1) un dominio de bloqueo de la transcripción bacteriano o de bacteriófago que puede unirse a un operador bacteriano o de bacteriófago, en la que el operador está operativamente ligado a un promotor que puede accionar la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés, y en la que la unión del dominio de bloqueo al operador puede inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés, y

(2) un dominio de unión a ligando de un receptor de estrógeno humano que tiene las mutaciones G400V, M543A y L544A que se une tamoxifeno, en la que en presencia de tamoxifeno estabiliza la proteína de fusión.

La invención también proporciona una proteína de fusión reguladora codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención.

La invención también proporciona una célula eucariota capaz de expresión inducible de una secuencia de nucleótidos de interés, que comprende

(a) una secuencia de nucleótidos de interés operativamente ligada a un promotor que puede accionar la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés;

(b) un operador bacteriano o de bacteriófago operativamente ligado a un promotor; y

(c) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión reguladora, en la que la proteína de fusión consiste en:

(1) un dominio de bloqueo de la transcripción bacteriano o de bacteriófago que puede unirse al operador e inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés, y

(2) un dominio de unión a ligando de un receptor de estrógeno humano que tiene las mutaciones G400V, M543A y L544A, que se une tamoxifeno;

en la que en presencia de tamoxifeno que se une al dominio de unión a ligando de la proteína de fusión inhibe la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés, y en la que eliminación de tamoxifeno produce expresión inducida del nucleótido de interés.

La invención también proporciona un animal transgénico no humano que comprende la célula de la invención.

El dominio de bloqueo de la transcripción es una proteína que puede unirse a ADN y bloquear la transcripción del promotor adyacente. En realizaciones más específicas, el dominio de bloqueo de la transcripción está seleccionado del grupo que consiste en TetR, LexA, LacI, TrpR, Arc y LambdaCl.

Puede usarse una variedad de células eucariotas en el procedimiento de la invención, que incluyen sin limitación, una célula de levadura, tal como Pichia pastoris, o una célula de mamífero, tal como una célula COS, CHO, 293, BHK o NSO.

La presente invención puede usarse ampliamente en la transcripción de una secuencia de nucleótidos de interés, y el producto de interés puede ser el producto de transcripción, por ejemplo, un ARNm o ARN catalíticamente activo, o un producto en la dirección 3' resultante de la secuencia de nucleótidos transcrita de interés, por ejemplo, una proteína o fragmento de proteína, que incluye sin limitación... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de inducción de la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés en una célula eucariota, que comprende:

(a) proporcionar una célula eucariota que comprende

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión reguladora (RPR) , en la que la proteína de fusión consiste en

(1) un dominio de bloqueo de la transcripción bacteriano o de bacteriófago que puede inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés, y

(2) un dominio de unión a ligando que comprende un dominio de unión a ligando de receptor de estrógeno humano que tiene las mutaciones G400V, M543A y L544A, que se une tamoxifeno;

(ii) un promotor operativamente ligado a la secuencia de nucleótidos de interés y controlado por un operador bacteriano o de bacteriófago que puede unirse al dominio de bloqueo de la transcripción bacteriano o de bacteriófago y bloquear la transcripción del promotor;

(b) cultivar la célula de la etapa (a) a una densidad deseada en presencia de tamoxifeno que se une el dominio de unión a ligando de la proteína de fusión, inhibiéndose la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés; y

(c) eliminar el tamoxifeno de la presencia de la célula, induciéndose la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el dominio de bloqueo de la transcripción es aminoácidos M1 a S207 del represor tet y el dominio de bloqueo de la transcripción está fusionado con aminoácidos N304 a V595 del receptor de estrógeno que tiene las mutaciones G400V, M543A y L544A.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el dominio de bloqueo de la transcripción se deriva de una proteína de bloqueo de la transcripción bacteriana seleccionada del grupo que consiste en TetR, LexA, LacI, TrpR, Arc y LambdaCl.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el dominio de bloqueo de la transcripción es un dímero de represor Arc que comprende monómeros Arc de P22 conectados por un ligador de GGGSGGGTGGGSGGG (SEC ID Nº: 2) , y en el que el dominio de bloqueo de la transcripción está ligado al dominio de unión a ligando de receptor de estrógeno humano por un ligador de AYSGSRELIRL (SEC ID Nº: 1) .

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos codifica una proteína de fusión que consiste en SEC ID Nº: 3.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el operador es un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción mutada que puede unirse a, pero no escindir, ADN y el dominio de bloqueo de la transcripción es una enzima de restricción mutada que puede unirse a, pero no escindir, ADN.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el dominio de bloqueo de la transcripción es una enzima NotI mutada.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el promotor operativamente ligado a la secuencia de nucleótidos de interés se deriva del CMV, SV40, virus del sarcoma de Rous, metalotioneína, nopalina sintetasa, virus del mosaico de la coliflor 35S ARN, ribulosa bifosfato carboxilasa, Gal4, alcohol deshidrogenasa, fosfoglicerol cinasa, fosfatasa alcalina, elastasa I; insulina; inmunoglobulina; virus del tumor mamario de ratón; albúmina; ∀-fetoproteína ; ∀1-antitripsina; #-globina; y cadena ligera de miosina 2.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el promotor es CMV-MIE.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula eucariota está seleccionada del grupo que consiste en una célula COS, CHO, 293, BHK o NSO.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el operador es TetO o ArcO.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el operador está colocado inmediatamente en la dirección 3' del promotor.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el operador está colocado dentro de 10 pares de bases del promotor.

14. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una proteína de fusión reguladora, en la que la proteína de fusión consiste en

(1) un dominio de bloqueo de la transcripción bacteriano o de bacteriófago que puede unirse a un operador

bacteriano o de bacteriófago, en el que el operador está operativamente ligado a un promotor que puede accionar la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés, y en el que la unión del dominio de bloqueo al operador puede inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés, y

(2) un dominio de unión a ligando de un receptor de estrógeno humano que tiene las mutaciones G400V,

M543A y L544A que se une a tamoxifeno, 10 en la que en presencia de tamoxifeno se estabiliza la proteína de fusión.

15. Una proteína de fusión reguladora codificada por la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 14.

16. Una célula eucariota capaz de expresión inducible de una secuencia de nucleótidos de interés, que comprende 15

(a) una secuencia de nucleótidos de interés operativamente ligada a un promotor que puede accionar la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés;

(b) un operador bacteriano o de bacteriófago operativamente ligado a un promotor; y

(c) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión reguladora, en la que la proteína de fusión 20 consiste en:

(1) un dominio de bloqueo de la transcripción bacteriano o de bacteriófago que puede unirse al operador e inhibir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés, y

(2) un dominio de unión a ligando de un receptor de estrógeno humano que tiene las mutaciones G400V,

M543A y L544A, que se une tamoxifeno; en la que en presencia de tamoxifeno que se une al dominio de unión a ligando de la proteína de fusión se inhibe la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés, y en la que la eliminación de tamoxifeno produce expresión inducida del nucleótido de interés.

17. Un animal transgénico no humano que comprende la célula de la reivindicación 16.