Recombinación homóloga mejorada mediada por proteínas de recombinación de lambda.

Un método para inducir la recombinación homóloga en una célula que comprende un ácido nucleico diana,

comprendiendo el método :

la introducción en una célula de un primer ácido nucleico de 5 interés que comprende una secuencia homóloga al ácidonucleico diana de longitud suficiente como para inducir la recombinación homóloga y donde el primer ácido nucleico deinterés es un ADN de cadena única o un ADN que comprende un extremo 3' protuberante, donde la célula comprendeun ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión a ADN de cadena única que funciona en la recombinaciónhomóloga de reparación de roturas bicatenarias, operativamente unido al promotor PL, y

la inducción de una expresión suficiente del ácido nucleico que codifica el polipéptido de unión a ADN de cadena únicapara promover la recombinación homóloga del primer ácido nucleico de interés con el ácido nucleico diana;

induciendo así la recombinación homóloga en la célula.

Recombinación homóloga mejorada mediada por proteínas de recombinación de lambda La presente divulgación se refiere a métodos para mejorar la recombinación homóloga en bacterias y células eucariotas empleando proteínas de recombinación, como las obtenidas del bacteriófago lambda. También se refiere a métodos para modificar el ADN genómico en cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y para subclonar el ADN genómico de los BAC en plásmidos multicopia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El uso concertado de endonucleasas de restricción y ligasas de ADN permite la recombinación in vitro de secuencias de ADN. El ADN recombinante generado mediante restricción y enlace puede ser amplificado en un microorganismo apropiado, como E. coli, y usado para diversos fines, incluyendo la terapia genética. No obstante, el planteamiento de restricción-enlace presenta dos limitaciones prácticas: en primer lugar, las moléculas de ADN solamente pueden ser combinadas de forma precisa, si se dispone de sitios de restricción apropiados; en segundo lugar, dado que los sitios de restricción útiles a menudo se repiten en un tramo largo de ADN, el tamaño de los fragmentos de ADN que se pueden manipular es limitado, normalmente inferior a unas 25 kilobases.

La recombinación homóloga, definida generalmente como un intercambio entre segmentos homólogos en cualquier punto a lo largo de dos moléculas de ADN, proporciona un método alternativo para modificar el ADN. Al generar ADN recombinante con una recombinación homóloga, un microorganismo, como E. coli, o una célula eucariota, como una levadura, o una célula de vertebrado, se transforma con ADN exógeno. El centro del ADN exógeno contiene el transgen deseado, mientras que cada uno de los flancos contiene un segmento de homología con el ADN de las células. El ADN exógeno se introduce en la célula con técnicas estándar, como la electroporación o la transfección mediada por fosfato cálcico, y se recombina en el ADN de la célula, por ejemplo con la ayuda de proteínas que promueven la recombinación en la célula.

Para generar ADN recombinante mediante recombinación homóloga, a menudo es beneficioso trabajar con segmentos lineales cortos de ADN. Por ejemplo, se puede introducir una mutación en un segmento lineal de ADN empleando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . En las circunstancias apropiadas, la mutación puede ser introducida posteriormente en el ADN celular mediante recombinación homóloga. Estos segmentos lineales cortos de ADN pueden transformar una levadura, aunque la manipulación posterior del ADN recombinante en la levadura es laboriosa. Por lo general, resulta más sencillo trabajar con bacterias, aunque los fragmentos lineales de ADN no transforman fácilmente las bacterias (debido en parte a la degradación provocada por las exonucleasas bacterianas) . Por consiguiente, los elementos recombinantes son poco comunes, requieren cadenas de crecimiento limitado especiales (como las cadenas de RecBCD-mutante) y, por lo general, precisan miles de pares de bases de homología. Así pues, se necesitan métodos mejorados para promover la recombinación homóloga en las bacterias.

En las células eucariotas, la recombinación homóloga selectiva sienta la base para dirigirse a cualquier secuencia deseada de una molécula de ADN dúplex y modificarla esencialmente, como dirigirse a una secuencia de ADN de un cromosoma para la sustitución por otra secuencia. El planteamiento puede resultar útil para el tratamiento de enfermedades genéticas humanas.

La recombinación homóloga se ha utilizado para crear animales knock-out, mutantes y transgénicos, por lo que ha desempeñado un papel sumamente importante para el conocimiento de la función genética. Los animales transgénicos son organismos que contienen copias establemente integradas de genes o estructuras genéticas obtenidas de otra especie en el cromosoma del animal transgénico. Estos animales se pueden generar introduciendo estructuras de ADN clonado de los genes extraños en células totipotentes mediante diversos métodos, incluyendo la recombinación homóloga.

En la actualidad, los métodos para producir transgénicos se han aplicado en células madre embriónicas (ES) totipotentes con cigotos fertilizados. Las células ES presentan una ventaja en el sentido de que se pueden manipular in vitro grandes cantidades de células, antes de emplearlas para generar transgénicos. Alternativamente, también se puede introducir el ADN en oocitos fertilizados mediante microinyección en el pronúcleo o inyectarse en la línea germinal de organismos, incluyendo las especies C. elegans o Drosophila.

Se han desarrollado diversos métodos para detectar y/o seleccionar recombinantes de sitio específico diana entre el ADN del vector y la secuencia cromosómica homóloga diana (Capecchi, Science 244: 1288, 1989) . Las células que presentan un fenotipo específico tras la recombinación, tal como ocurre con la alteración del gen de hipoxantina fosforibosiltransferasa (hprt) , se pueden obtener mediante selección directa en el medio de crecimiento adecuado. Alternativamente, se puede incorporar un marcador seleccionable, como la resistencia a la neomicina, en un vector bajo control de un promotor, y se puede valorar el éxito de la transfección seleccionando células resistentes a G418 (Joyner et al., Nature 338:153, 1989) . Se han descrito muchos otros procedimientos de selección (Jasin y Berg, Genes and Development 2: 1353, 1988; Doetschman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 85: 8583, 1988; Dorini et al., Science 243: 1357, 1989; Itzhaki y Porter, Nucl. Acids Res. 19: 3835, 1991) . Lamentablemente, las secuencias exógenas

transferidas a las células eucariotas solamente se someten a recombinación homóloga a frecuencias muy bajas, incluso cuando hay presentes regiones de homología muy largas (Koller et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) , 88:10730, 1991, y Snouwaert et al. Science 257:1083, 1992) . Por tanto, es necesario transfectar, seleccionar y estudiar grandes números de células, a fin de generar un recombinante homólogo correctamente selectivo.

Muniyappa et al., J. Biol. Chem., V261, nº 16, p7472-7478, 1986, se refiere al fago lambda. Datsenko et al., PNAS, 97, pp 6640-6645, 2000, se refiere a la recombinación homóloga en lambda. Huang et al., Gene, 251, pp 187-197, 2000, se refiere a un promotor de arabinosa. Yu et al., PNAS, 97, pp5978-5983, 2000, se refiere a recombinación homóloga en lambda.

RESUMEN DE LA DIVULGACIÓN

La presente divulgación proporciona métodos para clonar moléculas de ADN en células que tienen un ADN que codifica recombinasas de lambda operativamente unidas a un promotor susceptible de desrepresión, como por ejemplo el promotor PL del fago lambda. El promotor PL es activado, mediante un cambio de temperatura, permitiendo así la expresión de recombinasas lambda. Las recombinasas lambda promueven la recombinación homóloga entre los ácidos nucleicos de la célula. Los ácidos nucleicos que se someten a recombinación pueden ser intracromosómicos o extracromosómicos, por ejemplo en un cromosoma artificial bacteriano.

La presente divulgación también proporciona métodos para inducir la recombinación homóloga empleando moléculas de ADN de cadena única, mediante la introducción en el ADN de la célula capaz de someterse a recombinación homóloga, y un polipéptido de unión a ADN de cadena única capaz de promover la recombinación homóloga. Estos polipéptidos de unión a ADN de cadena única incluyen el lambda Beta, RecT, P22 Erf y Rad52, así como variantes y fragmentos funcionales de los polipéptidos de unión a ADN de cadena única.

La presente divulgación también proporciona células bacterianas que promueven una recombinación homóloga eficiente. Estas células bacterianas contienen uno o más genes o promotores de un profago lambda defectuoso dentro del cromosoma bacteriano.

La divulgación también proporciona métodos para alterar los genes eucariotas, expresando recombinasas operativamente vinculadas a un promotor susceptible de desrepresión en las células bacterianas. Los genes eucariotas así modificados pueden ser empleados para modificar células eucariotas, por ejemplo para generar animales transgénicos o knockout.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Fig. 1 es una ilustración lineal del profago lambda defectuoso y está integrado en el cromosoma de E. coli. Los genes de profago están indicados con la línea continua y los genes de E. coli mediante líneas discontinuas. Las regiones de codificación para los genes de recombinación de lambda -exo, bet y gam- se encuentran aproximadamente en el centro del profago defectuoso. Los genes de lambda, cro a attR,... [Seguir leyendo]

1. Un método para inducir la recombinación homóloga en una célula que comprende un ácido nucleico diana, comprendiendo el método :

la introducción en una célula de un primer ácido nucleico de interés que comprende una secuencia homóloga al ácido nucleico diana de longitud suficiente como para inducir la recombinación homóloga y donde el primer ácido nucleico de interés es un ADN de cadena única o un ADN que comprende un extremo 3’ protuberante, donde la célula comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión a ADN de cadena única que funciona en la recombinación homóloga de reparación de roturas bicatenarias, operativamente unido al promotor PL, y

la inducción de una expresión suficiente del ácido nucleico que codifica el polipéptido de unión a ADN de cadena única para promover la recombinación homóloga del primer ácido nucleico de interés con el ácido nucleico diana;

induciendo así la recombinación homóloga en la célula.

2. El método de la reivindicación 1, donde el polipéptido de unión a ADN de cadena única es Beta de lambda y la célula comprende también un ácido nucleico que codifica Gam y una proteína seleccionada del grupo compuesto por Exo, F12A21.16 de Arabidopsis, orf del virus del cólera, gen YqaJ de B. subtilis, fago A118 gp47 de Listeria, gen 34.1 del fago SPP1 de B. subtilis, y orf del virus de la peste porcina africana operativamente unido al promotor PL susceptible de desrepresión.

3. El método de la reivindicación 1, donde el método comprende también la introducción de una segunda secuencia de ADN de cadena única, donde la segunda secuencia de ADN de cadena única comprende más de 10 bp de solapamiento complementario en el extremo 5’ o 3’ del primer ácido nucleico de interés.

4. El método de la reivindicación 1, donde la célula es una célula bacteriana o una célula eucariota.

5. El método de la reivindicación 4, donde la célula eucariota es una célula de mamífero.

6. El método de la reivindicación 5, donde la célula de mamífero es una célula madre.

7. El método de la reivindicación 1, donde el primer ácido nucleico de interés codifica un marcador seleccionable.

8. Un método para realizar la recombinación homóloga de una secuencia de nucleótidos de interés en una célula hospedadora, que comprendeintroduccir una secuencia de ácido nucleico que codifica los productos genéticos de Exo, Beta y Gam de lambda, o un homólogo de los mismos que posea al menos un 60% de identidad de secuencia, operativamente unido al promotor PL;

introduccir el polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos homóloga a la secuencia de nucleótidos de interés en las células hospedadoras, donde el nucleótido de interés es un ADN de cadena única o un ADN que comprende un extremo 3’ protuberante;

activar el promotor PL en las células, induciendo así la expresión de los productos genéticos de Exo, Beta y Gam de lambda, u homólogos de los mismos;

seleccionar una célula de la población de células hospedadoras en las que se ha producido la recombinación homóloga entre el ácido nucleico de interés y una secuencia de ácido nucleico diana.

9. El método de la reivindicación 8, donde al menos una célula de 100.000 de la población de células hospedadoras contiene ADN en el que se ha ocurrido recombinación homóloga.

10. El método de la reivindicación 8, donde al menos una célula de 1.000 de la población de células hospedadoras contiene ADN en el que se ha ocurrido recombinación homóloga.

11. El método de la reivindicación 10, donde al menos una célula de 100 de la población de células hospedadoras contiene ADN en el que se ha ocurrido recombinación homóloga.

12. El método de la reivindicación 8, donde la secuencia de nucleótidos de interés es intracromosómica o extracromosómica.

13. El método de la reivindicación 12, donde la secuencia de nucleótidos de interés es extracromosómica y está ubicada en un cromosoma artificial bacteriano, un cromosoma artificial de P1, un plásmido, un cósmido o un cromosoma artificial de levadura.

14. Un método para la clonación de una molécula de ácido nucleico, que es un ADN de cadena única o un ADN que comprende un extremo 3’ protuberante, en una célula, que comprende:

introduccir en una célula hospedadora que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica los productos genéticos de Exo, Beta y Gam de lambda, o un homólogo de los mismos que posea al menos un 60% de identidad de la secuencia, operativamente unido al promotor PL, un vector que comprende un número suficiente de nucleótidos homólogos a un ácido nucleico diana como para conseguir la recombinación homóloga;

activar el promotor PL en la célula hospedadora, induciendo así la expresión de los productos genéticos de Exo, Beta y Gam de lambda, o la variante funcional u homóloga de los mismos;

seleccionar una célula hospedadora en la que la recombinación homóloga se ha producido entre el vector y una secuencia de ácido nucleico diana, clonando así la molécula de ácido nucleico.

15. Un método para alterar una secuencia de ácido nucleico eucariota, que comprende:

introduccir un ácido nucleico de interés en una célula bacteriana que comprende un elemento extracromosómico que comprende al menos un intrón o al menos un exón de una secuencia de ácido nucleico eucariota;

donde el ácido nucleico de interés comprende un número de nucleótidos homólogos a la secuencia de ácido nucleico eucariota suficiente como para mediar la recombinación homóloga y es un ADN de cadena única o un ADN con el extremo 3’ protuberante;

y donde la célula bacteriana comprende el promotor PL operativamente unido a una secuencia de ácido nucleico que codifica una recombinasa; y

activar la expresión de la recombinasa a partir del promotor PL;

donde la expresión de la recombinasa provoca que el ácido nucleico de interés se someta a recombinación homóloga con la secuencia de ácido nucleico eucariota.

16. El método de la reivindicación 15, donde la recombinasa es una proteína de unión a ADN de cadena única.

17. El método de la reivindicación 15, donde el ácido nucleico que codifica la recombinasa codifica el producto genético de Beta de lambda.

18. El método de la reivindicación 15, donde el ADN que codifica la recombinasa a expresar codifica también el producto genético de Exo de lambda o el producto genético de Gam de lambda.

19. El método de la reivindicación 15, donde el elemento extracromosómico es un cromosoma artificial bacteriano, un cromosoma artificial de levadura, un cromosoma artificial de P1, un plásmido o un cósmido.

20. El método de la reivindicación 15, donde la secuencia de ácido nucleico eucariota es una secuencia de ácido nucleico de mamífero.

21. El método de la reivindicación 15, donde el ácido nucleico de interés codifica una etiqueta del epítopo.

22. Un método de subclonación de una secuencia de ADN, que comprende:

proporcionar la célula bacteriana que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica los productos genéticos Exo, Beta y Gam de lambda, o un homólogo de los mismos que posea al menos un 60% de identidad de la secuencia, operativamente unido al promotor PL, y que comprende también una molécula de ADN con una secuencia de ácido nucleico diana ubicada extracromosómicamente;

introduccir en la célula bacteriana un vector de plásmido lineal que comprende un origen de replicación y un marcador seleccionable, y comprende una secuencia de nucleótidos que es un ADN de cadena única o un ADN que tiene un extremo 3’ protuberante capaz de someterse a recombinación homóloga con la secuencia de ácido nucleico diana en el ADN;

induccir la expresión del ácido nucleico que codifica los productos genéticos de Exo, Beta y Gam de lambda, induciendo así la recombinación homóloga entre el vector de plásmido lineal y la secuencia de ácido nucleico diana; donde el ácido nucleico diana es insertado en el vector de plásmido lineal; y

circularizarel vector de plásmido lineal, subclonando así el ADN.

23. El método de la reivindicación 22 donde el ADN comprende al menos 20 kb del ADN extracromosómico.

24. El método de la reivindicación 22 donde el ADN comprende al menos 40 kb del ADN extracromosómico.

25. El método de la reivindicación 22 donde el ADN comprende al menos 80 kb del ADN extracromosómico.

26. El método de la reivindicación 22, donde el ADN extracromosómico es un cromosoma artificial bacteriano.