Reactivos y métodos para el aislamiento de ARN purificado.

Composición monofásica que contiene fenol para aislar el ARN purificado de una muestra biológica que comprende fenol y un tampón mezclados junto con la muestra biológica,

estando el fenol a una concentración final que oscila de 3% p/p a menos de 30% p/p, y siendo el tampón suficiente para mantener un pH de la mezcla dentro del intervalo de pH 3,6 a pH 5,5.

Reactivos y métodos para el aislamiento de ARN purificado

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a las composiciones y métodos que mejoran el aislamiento de ARN purificado a 5 partir de muestras biológicas.

ANTECEDENTES

El aislamiento de ARN intacto puro es una etapa crítica para el análisis de la expresión genética en aplicaciones biotecnológicas, clínicas y de biología molecular. Los métodos de aislamiento de ARN se han desarrollado con vistas a lograr este objetivo. Los métodos utilizados con mayor frecuencia para el aislamiento de ARN se basan en la extracción de fenol, la precipitación a partir de soluciones de sales caotrópicas y la adsorción sobre sílice (Ausubel et al, 2002) , analizados en mis patentes de EE. UU. núms. 4.843.155, 5.346.994 y 5.945.515. Se suele hacer referencia al método descrito en la patente ‘155 como el método de una sola etapa y éste extrae ARN con una solución de fenol-guanidina a pH 4. Su efectividad y simplicidad hacen del método de una sola etapa el método utilizado con más frecuencia para aislar ARN.

Una mejora del método de una sola etapa, descrita en mi siguiente patente ‘944, permitió el aislamiento simultáneo de ARN, ADN y proteínas de la misma muestra mediante la extracción de fenol-guanidina a pH 4 - 6. Una muestra biológica se homogeneiza y el homogeneizado se somete a separación de fases empleando un solvente orgánico hidrofóbico como el cloroformo o el bromocloropropano. Después de la centrifugación, la mezcla se separa entre la fase acuosa superior que contiene ARN, y la interfase y la fase orgánica que contienen ADN y proteínas. La fase acuosa se recoge y el ARN se precipita y lava con alcohol.

En el método de una sola etapa descrito en las patentes ‘155 y ‘994, una recogida cuidadosa de la fase acuosa separada es importante para la calidad del ARN aislado. Pequeñas cantidades de la interfase y de la fase orgánica pueden eliminarse fácilmente junto con la fase acuosa, lo que conlleva contaminación del ARN aislado con ADN y proteínas. Además, la recogida de la fase acuosa requiere una aproximación manual, que es un obstáculo para la adaptación del método de una sola etapa a la automatización.

Los reactivos y métodos descritos en las patentes ‘155 y ‘994 proporcionan ARN no degradado sustancialmente puro. No obstante, el ARN aislado según las patentes ‘155 y ‘994 contiene una cantidad residual de ADN genómico, que puede ser detectada mediante ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés) . De este modo, el ARN aislado según las patentes ‘155 30 y ‘944 debe purificarse además para convertirlo en libre de ADN (Guan at al, 2003; Girotti y Zingg, 2003) . El ADN genómico contaminante sirve como matriz para ADN polimerasa, produciendo productos de amplificación adicionales y distorsionando la RT-PCR dependiente de ARN. La contaminación de ADN en la RT-PCR sólo puede ser mitigada parcialmente empleando un set de cebadores que incluyen secuencias intrón-exón en el ADN genómico porque la presencia de pseudogenes, que no contienen intrones, hace este enfoque poco fiable (Mutimer 1998) .

Las modificaciones en el método de una sola fase han mejorado la calidad del ARN aislado. En una modificación, se eliminaron los inhibidores de la RT-PCR añadiendo una etapa de precipitación de cloruro de litio (Puissant, 1990; Mathy, 1996) . En otra modificación, la precipitación con alcohol de ARN en presencia de sal aumentó la pureza del ARN aislado (Chomczynski, 1995) . No obstante, estas modificaciones no fueron eficaces para la eliminación de la contaminación de ADN.

Una práctica común para eliminar ADN contaminante es tratar una muestra que contiene ARN con deoxiribonucleasa (DNasa) . Después del tratamiento con DNasa, la muestra que contiene ARN se extrae secuencialmente con fenol y cloroformo. En un esfuerzo por limitar la contaminación de ADN, se incluyó una etapa de precipitación de ADN adicional en el método de una sola fase. El ADN contaminante se precipitó a partir 45 de la fase acuosa añadiendo un tercio del volumen de etanol al 95% p/p (Siebert, 1993) . La concentración final de etanol fue aproximadamente al 24% p/p. El autor indicó que, a esta concentración baja de etanol, el ADN se precipitó mientras que el ARN se mantuvo en la solución. El ARN se precipitó a partir de la solución añadiendo alcohol adicional. No obstante, este protocolo produjo ARN que todavía estaba contaminado con ADN, prueba de ello era una banda visible después de analizar el ARN aislado sobre un gel de agarosa teñido con bromuro de 50 etidio y mediante RT-PCR.

En otro esfuerzo por disminuir la contaminación de ADN y mejorar la calidad de ARN en el método de una sola etapa, Monstein (1995) , en un procedimiento laborioso, aumentó el pH de la extracción con fenol a pH 4, 1 4, 7 y trató la muestra con proteinasa K, seguido de otra ronda de extracción con fenol, precipitación y lavado con etanol. A pesar de este procedimiento prolongado, el tratamiento con DNasa era todavía necesario para obtener ARN libre de ADN preparado para usar en la RT-PCR.

También se logró separar ARN de ADN mediante extracción con fenol a pH 4 sin añadir sales de guanidina (Kedzierski, 1991) . No obstante, la ausencia de sales de guanidina durante el procedimiento convirtió 5 el ARN en susceptible a la ribonucleasa (RNasa) , degradando de este modo el ARN. Una mejora posterior de este protocolo empleó tampón de extracción con fenol a pH 4, 2 en presencia de dodecilsulfato sódico (Chattopadhyay et al., 1993) . El tratamiento con DNasa también era necesario en el método de aislamiento de ARN utilizando una combinación del método de una sola etapa seguido del proceso de columna de sílice (Bonham, 1996) . El uso de este protocolo de purificación doble disminuyó la contaminación del ADN, pero el

ARN aislado todavía contenía ADN genómico que fue detectado mediante RT-PCR. Otro método para aislar ARN utilizaba una solución acuosa monofásica que contenía fenol 10% p/p a 60% p/p (Publicación de solicitud de patente estadounidense 20030204077) . En ausencia de caotropos, se utilizó poliol, diol o monoalcohol 15% p/p a 55% p/p para mantener fenol en una solución acuosa.

Por consiguiente, una cantidad residual de ADN presente en el ARN aislado con los métodos descritos en las patentes ‘155 y ‘994 hace necesario extender el procedimiento incluyendo el tratamiento con DNasa. Esto disminuyó la utilidad de los métodos al prolongar los procedimientos y exponer de modo innecesario el ARN a la posibilidad de degradación durante el tratamiento con DNasa y las etapas de purificación adicional. Sin embargo, la eliminación del ADN residual de la preparación de ARN es necesaria para la determinación de micromatriz basada en la RT-PCR de la expresión génica.

Los métodos anteriores para el aislamiento de ARN, como se describen en las patentes ‘155 y ‘994, se basaban en la extracción con fenol llevada a cabo a pH 4 o superior. Ninguna de las modificaciones previas del método de una sola etapa buscaba mejorar la calidad del ARN llevando a cabo extracción con fenol a un pH inferior a 4. Al contrario, el pH 4 como se utiliza en la primera patente ‘155 se aumentó en la siguiente patente ‘944 a un pH que oscilaba de 4 a 6. De modo similar, el protocolo descrito por Monstein (1995) aumentó el pH de la extracción con fenol a pH 4, 7. Otro intento elaborado por mejora el método de una sola fase aumentó el pH del extracto de guanidina-fenol a pH 5, 2 (Suzuki, 2003) .

Una alternativa al método de una sola etapa de aislamiento de ARN se divulgó en la patente de EE. UU. núm. 5.973.137, utilizando sales ácidas no caotrópicas. Sin embargo, el método de extracción con fenol de una sola etapa es todavía el método más frecuentemente utilizado para el aislamiento de ARN. Una publicación que describe el método de una sola etapa (Chomczynski 1987) es el cuarto documento más citado en la base de datos de la American Chemical Society y del Institute for Scientific Information, y el documento más citado publicado en los últimos veinte años (CAS 2003, American Chemical Society) .

Por tanto, nuevos métodos para mejorar la pureza del ARN aislado son convenientes.

Entre otras publicaciones se incluyen WO 01/46402, US 4843155, CN 1220995 y US 5346994. 35 WO01/4640 expone el uso de la extracción con fenol/cloroformo a pH 4 para aislar ARN.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Según la presente invención se proporciona:

• Una composición monofásica que contiene fenol para aislar ARN purificado... [Seguir leyendo]

1. Composición monofásica que contiene fenol para aislar el ARN purificado de una muestra biológica que comprende fenol y un tampón mezclados junto con la muestra biológica, estando el fenol a una concentración final que oscila de 3% p/p a menos de 30% p/p, y siendo el tampón suficiente para mantener un pH de la mezcla dentro del intervalo de pH 3, 6 a pH 5, 5.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que el tampón está seleccionado de al menos uno de entre acetato, citrato, fosfato, ftalato, tartrato, lactato o mezclas de los mismos.

3. Composición según la reivindicación 1, que además comprende al menos un inhibidor de la ribonucleasa.

4. Composición según la reivindicación 1, que además comprende derivados de fenol seleccionados de al menos uno de entre feniletanol, fenoxitol de propileno, timol, butilfenol o mezclas de los mismos a una concentración final de hasta 5% p/p.

5. Composición según la reivindicación 1, que además comprende solubilizantes de fenol seleccionados de al menos uno de entre polialcoholes, monoalcoholes y sales de guanidina.

6. Composición según la reivindicación 1, que además comprende un detergente.

7. Composición según la reivindicación 1, que además comprende una sal inorgánica u orgánica y un agente quelante.

8. Método de precipitación de ácido fenólico para aislar el ARN purificado de una muestra biológica que comprende las etapas de:

(a) tratar la muestra biológica con un reactivo monofásico que comprende fenol a una concentración final que oscila de 3% p/p a menos de 30% p/p, y un tampón suficiente para mantener un pH de la composición en el intervalo de pH 3, 6 a pH 5, 5,

(b) dejar sedimentar o filtrar la mezcla resultante que contiene la muestra biológica para obtener una muestra biológica purificada sustancialmente libre de ADN, proteínas y 25 componentes celulares,

(c) añadir a la muestra biológica purificada un volumen igual de un solvente orgánico hidrosoluble para precipitar ARN purificado,

(d) dejar sedimentar o filtrar el ARN precipitado, y

(e) lavar y solubilizar el ARN precipitado.

9. Método según la reivindicación 8, en el que la muestra biológica se trata con la composición de la etapa (a) a una concentración de 1, 5X a 2, 5X, y la mezcla resultante que contiene la muestra biológica se diluye para aproximarse a la composición no concentrada de la etapa (a) de la reivindicación 8.

10. Método según la reivindicación 8, en el que el solvente añadido para precipitar el ARN es al menos uno de entre alcoholes inferiores, polialcoholes, acetona, diacetato de etilenglicol, sulfóxido de metilo o 35 mezclas de los mismos.

11. Método para aislar ARN purificado de una solución que contiene ARN y sal que comprende la preparación de la muestra biológica según la reivindicación 8, que comprende además las etapas de: ajustar un pH de la solución con un tampón en una cantidad suficiente para obtener un pH máximo de 3, 3 y precipitar a continuación el ARN purificado.

12. Método de la reivindicación 11, en el que el pH va de pH 3, 0 a pH 2, 7, y el tampón es al menos uno de un ácido orgánico o un ácido inorgánico.

13. Método de la reivindicación 11, en el que la sal esta seleccionada del grupo que consiste en sales de sodio, potasio, litio y guanidina.

14. Método de precipitación selectiva de ARN de peso molecular más elevado a partir de una muestra 45 biológica que comprende:

preparar la muestra biológica según la reivindicación 8;

tratar la muestra biológica con una composición acuosa que comprende fenol a una concentración final que va de 1% p/p a 60% p/p, al menos un caotropo, un tampón en una concentración suficiente para mantener un pH de la composición en el intervalo de pH 2, 0 a pH

9, 0, al menos un solvente orgánico hidrosoluble a una concentración de 10% p/p a 40% p/p para precipitar selectivamente ARN de peso molecular más elevado de la muestra biológica, y precipitar ARN de peso molecular más elevado purificado de la muestra biológica.

15. Método según la reivindicación 14, que además comprende la etapa de añadir a continuación un solvente orgánico adicional en una cantidad suficiente para aumentar la concentración del solvente orgánico a al menos 50% p/p con el fin de precipitar ARN de peso molecular inferior, y precipitar ARN de peso molecular inferior purificado de la muestra biológica.