Proteínas ligantes de antígeno que se unen a PAR-2.

Una proteína ligante de antígeno aislada que tiene una cadena pesada y una cadena ligera,

comprendiendo lacadena pesada una región variable que tiene una identidad de al menos 95% con respecto a la ID. SEC. nº 9, ycomprendiendo la cadena ligera una región variable que tiene una identidad de al menos 95% con respecto a la ID.SEC. nº 11, en donde la proteína ligante de antígeno se une a PAR2 humano no escindido y se une en menor gradoa PAR2 humano escindido.

Proteínas ligantes de antígeno que se unen a PAR-2.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EE.UU. Número de Serie 61/058.094, presentada el 2 de junio de 2008, y la Solicitud Provisional de EE.UU. Número de Serie 60/947.264, presentada el 29 de junio de 2007.

Campo de la invención Esta solicitud proporciona composiciones y métodos relativos a proteínas ligantes de antígeno PAR-2.

Antecedentes de la invención La familia de receptores activados por proteinasas (PAR; del inglés, proteinase-activated receptor) es una parte de la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G, de siete dominios transmembranales. Actualmente hay cuatro PARs conocidos, de los cuales tres (PARs-1, -3 y -4) son activados por trombina; un cuarto (PAR-2) es activado por tripsina o por triptasa de mastocito, pero no por trombina. Los PARs están ampliamente distribuidos por una diversidad de tejidos y participan en diversos fenómenos fisiológicos o patofisiológicos tales como agregación plaquetaria, inflamación y funciones cardiovasculares, digestivas o respiratorias.

Los PARs difieren de otros receptores en que la activación es iniciada por escisión proteolítica del extremo N del PAR, que forma luego un ligando atado que interacciona con la región extracelular (bucle 2) del mismo polipéptido receptor. La escisión de PAR-2 se produce entre los restos R y S del dominio de escisión por proteasas, SKGRSLIG (aminoácidos 33 a 40 de la ID. SEC. nº 2) , que está conservado entre los PAR-2 humano, murino y de rata. Se ha mostrado que péptidos que remedan el ligando atado presentan efectos agonistas sobre PAR-2 [Saifeddine et al., Br. J. Pharmacol. 118 (3) : 521-30 (1996) ; McGuire et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 309 (3) : 1124-31 (2004) ].

El PAR-2 activa las vías de transducción de señales comunes mediadas por receptores acoplados a proteínas G, la producción de inositol 1, 4, 5-trifosfato y la movilización de Ca (2+) , así como múltiples vías de cinasas, incluyendo ERK, p38MAPK, JNK e IKK. Está presente en células epiteliales y endoteliales, miocitos, fibroblastos, células inmunes, neuronas y células gliales, en el riñón, el páncreas, el estómago, el intestino, las vías aéreas, la piel, la vejiga y el cerebro. La proteasa que activa PAR-2 está presente durante la inflamación, y PAR-2 es suprarregulado por factores inflamatorios tales como el factor alfa de necrosis tumoral, la interleucina 1 alfa y el lipopolisacárido. Además, estudios en que se han usado ratones deficientes en PAR-2 o que lo sobreexpresan, confirman una función de este receptor en la inflamación [Schmidlin et al., J. Immunol. 169, 5315-5321 (2002) ; Ferrell et al., J. Clin. Invest. 111, 35-41 (2003) ].

Mandal et al., Blood 110, 161-170 (2007) , describen un antisuero policlonal hacia PAR-2, y Ui et al., Eur. J. Pharmacology 530, 172-178 (2006) , y Yoshida et al., Int. J. Mol. Med. 19, 335-340 (2007) , describen un anticuerpo anti-PAR-2 que se generó contra la secuencia atada de PAR-2 y no se une preferentemente al PAR-2 de longitud completa.

En consecuencia, en la técnica existe la necesidad de desarrollar antagonistas específicos de la activación de PAR2, que sean útiles para el tratamiento o la mejoría de estados inflamatorios.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 proporciona un conjunto de gráficos que permiten comparar los niveles de ciertas citocinas proinflamatorias presentes en tejido de pata de rata en un modelo de artritis inducida con adyuvante.

Sumario de la invención La invención es como se expone en las reivindicaciones.

La presente invención proporciona una proteína ligante de antígeno aislada que se une específicamente a PAR-2 humano no escindido y se une en menor grado a PAR-2 humano escindido. En otra realización, la proteína ligante de antígeno aislada comprende: a. un anticuerpo humano; b. un anticuerpo quimérico; c. un anticuerpo monoclonal;

d. un anticuerpo recombinante; e. un fragmento de anticuerpo ligante de antígeno; f. un anticuerpo de cadena sencilla; g. un diacuerpo; h. un triacuerpo; i. un tetracuerpo; j. un fragmento Fab; k. un fragmento F (ab') 2; l. un anticuerpo de dominio; m. un anticuerpo IgD; n. un anticuerpo IgE; o. un anticuerpo IgM; p. un anticuerpo IgG1; q. un anticuerpo IgG2; r. un anticuerpo IgG3; s. un anticuerpo IgG4; o t. un anticuerpo IgG4 que tiene al menos una mutación en una región bisagra que alivia la tendencia a formar un enlace disulfuro intra-cadenas H.

En otro aspecto de la invención, la presente invención proporciona una proteína ligante de antígeno aislada que tiene una cadena pesada y una cadena ligera, comprendiendo la cadena pesada una región variable que tiene una identidad de al menos 95% con respecto a la ID. SEC. nº 9, y comprendiendo la cadena ligera una región variable que tiene una identidad de al menos 95% con respecto a la ID. SEC. nº 11. En otro aspecto de la invención, la región variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 39, y la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 40.

En una realización de la invención, la región variable de cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDRs; del inglés, complementarity determining regions) denominadas CDR1, CDR2 y CDR3, y la región variable de cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) denominadas CDR1, CDR2 y CDR3. En otro aspecto de la invención, la región variable de cadena pesada comprende además cuatro regiones de armazón (FRs; del inglés, framework regions) denominadas FR1, FR2, FR3 y FR4, y la región variable de cadena ligera comprende además cuatro regiones de armazón (FRs) denominadas FR1, FR2, FR3 y FR4. En una realización de la invención, las CDRs de cadena pesada son seleccionadas de entre las CDRs de los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en las ID. SEC. números 9, 13 y 17, y las CDRs de cadena ligera son seleccionadas de entre las CDRs de los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en las ID. SEC. números 11, 15 y 19.

En un aspecto de la invención, las tres CDRs de cadena pesada son seleccionadas del mismo péptido; por ejemplo, las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada son de la ID. SEC. nº 9, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera son de la ID. SEC. nº 11, etc. En otra realización de la invención, las CDRs son seleccionadas de entre péptidos diferentes; por ejemplo, la CDR1 de cadena pesada es de la ID. SEC. nº 9, la CDR2 es de la ID. SEC. nº 13 y la CDR3 es de la ID. SEC. nº 17, y la CDR1 de cadena ligera es de la ID. SEC. nº 11, la CDR2 es de la ID. SEC. nº 15 y la CDR3 es de la ID. SEC. nº 19, etc. Alternativamente, dos CDRs pueden ser seleccionadas de un solo péptido y la tercera de otro péptido. Son posibles numerosas combinaciones. En otro aspecto, las regiones de armazón pueden ser seleccionadas del mismo péptido, o una o más regiones de armazón pueden ser seleccionadas de péptidos diferentes.

En un aspecto de la invención, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos anteriormente mencionados. En otro aspecto de la invención, el ácido nucleico es un vector. En otra realización de la invención, la invención proporciona células huésped transformadas o transfectadas con los ácidos nucleicos de la invención. En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para preparar un polipéptido, que comprende incubar las células huésped bajo unas condiciones que promueven la expresión de los polipéptidos y recolectar los polipéptidos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula aislada que secreta una proteína ligante de antígeno que se une a PAR-2. En otra realización, la célula es un hibridoma. En otra realización, la presente invención proporciona un método para preparar una proteína ligante de antígeno que se une a PAR-2 humano, que comprende incubar dicha célula aislada bajo unas condiciones que le permiten expresar dicha proteína ligante de antígeno.

En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína ligante de antígeno aislada que se une al receptor 2 activado por proteinasa (PAR-2) . En otra realización, la proteína ligante de antígeno aislada, cuando se une a un PAR-2 humano, inhibe la escisión proteolítica y/o la subsiguiente señalización a través de dicho PAR-2 humano. En otra realización, la proteína ligante de antígeno aislada inhibe la activación proteolítica de PAR-2 en más de aproximadamente un 80%. En otra realización, la proteína ligante de antígeno aislada inhibe la activación... [Seguir leyendo]

1. Una proteína ligante de antígeno aislada que tiene una cadena pesada y una cadena ligera, comprendiendo la cadena pesada una región variable que tiene una identidad de al menos 95% con respecto a la ID. SEC. nº 9, y comprendiendo la cadena ligera una región variable que tiene una identidad de al menos 95% con respecto a la ID. SEC. nº 11, en donde la proteína ligante de antígeno se une a PAR2 humano no escindido y se une en menor grado a PAR2 humano escindido.

2. Una proteína ligante de antígeno aislada que tiene una cadena ligera y una cadena pesada, comprendiendo la cadena ligera una región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 39, y comprendiendo la cadena pesada una región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 40, en donde la proteína ligante de antígeno se une a PAR2 humano no escindido y se une en menor grado a PAR2 humano escindido.

3. La proteína ligante de antígeno de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, en donde la región variable de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en la ID. SEC. nº 11, la ID. SEC. nº 15 y la ID. SEC. nº 19, y la región variable de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en la ID. SEC. nº 9, la ID. SEC. nº 13 y la ID. SEC. nº 17.

4. La proteína ligante de antígeno de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, seleccionada del grupo que consiste en

a) una proteína ligante de antígeno en donde la región variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 11, y la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 9;

b) una proteína ligante de antígeno en donde la región variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 15, y la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 13; y

c) una proteína ligante de antígeno en donde la región variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 19, y la región variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de ID. SEC. nº 17.

5. La proteína ligante de antígeno de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, comprendiendo la cadena pesada tres regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) denominadas CDR1, CDR2 y CDR3, y comprendiendo la cadena ligera tres regiones determinantes de la complementariedad denominadas CDR1, CDR2 y CDR3, en donde a) la CDR1 de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 31 a 35 de la ID. SEC. nº 9, los aminoácidos 31 a 35 de la ID. SEC. nº 13 y los aminoácidos 31 a 35 de la ID. SEC. nº 17;

b) la CDR2 de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 50 a 66 de la ID. SEC. nº 9, los aminoácidos 50 a 66 de la ID. SEC. nº 13 y los aminoácidos 50 a 66 de la ID. SEC. nº 17; y

c) la CDR3 de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 99 a 115 de la ID. SEC. nº 9, los aminoácidos 99 a 115 de la ID. SEC. nº 13 y los aminoácidos 99 a 115 de la ID. SEC. nº 17; y

a') la CDR1 de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 23 a 33 de la ID. SEC. nº 11, los aminoácidos 23 a 33 de la ID. SEC. nº 15 y los aminoácidos 23 a 33 de la ID. SEC. nº 19;

b') la CDR2 de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 49 a 55 de la ID. SEC. nº 11, los aminoácidos 49 a 55 de la ID. SEC. nº 15 y los aminoácidos 49 a 55 de la ID. SEC. nº 19; y

c') la CDR3 de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 88 a 97 de la ID. SEC. nº 11, los aminoácidos 88 a 97 de la ID. SEC. nº 15 y los aminoácidos 88 a 97 de la ID. SEC. nº 19.

6. La proteína ligante de antígeno de la Reivindicación 5, comprendiendo además la cadena pesada de una a cuatro regiones de armazón (FRs) denominadas FR1, FR2, FR3 y FR4, y comprendiendo además la cadena ligera de una a cuatro regiones de armazón denominadas FR1, FR2, FR3 y FR4, en donde a) la FR1 de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1 a 30 de la ID. SEC. nº 9, los aminoácidos 1 a 30 de la ID. SEC. nº 13 y los aminoácidos 1 a 25 de la ID. SEC. nº 17;

b) la FR2 de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 36 a 49 de la ID. SEC. nº 9, los aminoácidos 36 a 49 de la ID. SEC. nº 13 y los aminoácidos 36 a 49 de la ID. SEC. nº 17;

c) la FR3 de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 67 a 98 de la ID. SEC. nº 9, los aminoácidos 67 a 98 de la ID. SEC. nº 13 y los aminoácidos 67 a 98 de la ID. SEC. nº 17; y

d) la FR4 de cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 116 a 126 de la ID. SEC. nº 9, los aminoácidos 116 a 126 de la ID. SEC. nº 13 y los aminoácidos 116 a 126 de la ID. SEC. nº 17; y

a') la FR1 de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1 a 22 de la ID. SEC. nº 11, los aminoácidos 1 a 22 de la ID. SEC. nº 15 y los aminoácidos 1 a 22 de la ID. SEC. nº 19;

b') la FR2 de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 34 a 48 de la ID. SEC. nº 11, los aminoácidos 34 a 48 de la ID. SEC. nº 15 y los aminoácidos 34 a 48 de la ID. SEC. nº 19;

c') la FR3 de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 56 a 87 de la ID. SEC. nº 11, los aminoácidos 56 a 87 de la ID. SEC. nº 15 y los aminoácidos 56 a 87 de la ID. SEC. nº 19; y

d') la FR4 de cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 98 a 107 de la ID. SEC. nº 11, los aminoácidos 98 a 107 de la ID. SEC. nº 15 y los aminoácidos 98 a 107 de la ID. SEC. nº 19.

7. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína ligante de antígeno de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en donde el ácido nucleico es opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en:

a) un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de ID. SEC. nº 10, y un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de ID. SEC. nº 8;

b) un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de ID. SEC. nº 12, y un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de ID. SEC. nº 14; y

c) un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de ID. SEC. nº 16, y un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de ID. SEC. nº 18.

8. Un vector que comprende un ácido nucleico según la Reivindicación 7.

9. Una célula huésped aislada, transfectada o transformada con el vector de la Reivindicación 8.

10. Un método para la producción de una proteína ligante de antígeno, que comprende cultivar una célula huésped de la Reivindicación 9 bajo unas condiciones que promueven la expresión y recuperar la proteína del medio de cultivo.

11. Una composición que comprende un polipéptido de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6 y un diluyente, excipiente o vehículo fisiológicamente aceptable.