Polipéptido aislado que posee una actividad proteasa, y que presenta una temperatura de fusión (T m) de al menos 78ºC,

determinada por calorimetría diferencial de barrido (DSC) en 10 mM de tampón de sodio, 50 mM de cloruro de sodio, pH 7,0, usando una velocidad de barrido constante de 1,5ºC/min, donde el polipéptido es seleccionado del grupo consistente en:

(a) un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos que presenta un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2 y/o 1 a 188 de SEC ID Nº: 12 de al menos el 60%;

(b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que se hibridiza en condiciones de astringencia alta con cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11; y

(c) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que presenta un grado de identidad para cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11 de al menos el 72%.

Proteasas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene una actividad proteasa y es homólogo de las proteasas de Nocardiopsis, así como de secuencias de ácido nucleico aisladas codificantes de éste. La invención se refiere también a constructos de ácido nucleico, vectores, y a células huéspedes, incluyendo plantas transgénicas y animales no humanos, comprendiendo esas secuencias de ácidos nucleicos, así como métodos de producción y uso de la proteasa, en particular en alimentos para animales, por ejemplo en alimentos para peces.

La proteasa de la invención es termoestable, y se exponen unas cualidades estructurales características relevantes para la termoestabilidad de las proteasas de la familia peptidasa S2A o S1E.

La proteasa de la invención degrada eficazmente también el inhibidor de soja Bowman-Birk, así como otros factores antinutritivos como la aglutinina de soja, y el inhibidor de tripsina Kunitz, así como las proteínas de almacenamiento de soja aisladas como la glicinina y la beta-conglicinina.

Antecedentes de la invención

Las proteasas derivadas de la especie Nocardiopsis NRRL 18262 y Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 son descritas en WO 88/03947. Las secuencias de ADN y aminoácidos de la proteasa derivada de la especie Nocardiopsis NRRL 18262 son mostrados en la solicitud DK Nº. 1996 00013. WO 01/58276 expone el uso en alimentos para animales de proteasas estables al ácido relacionadas con las proteasas derivadas de la especie Nocardiopsis NRRL 18262, así como una proteasa derivada de Nocardiopsis alba DSM 14010. No obstante, estas proteasas no son termoestables.

JP 2-255081-A expone una proteasa derivada de una cepa de especie Nocardiopsis OPC-210 (FERM P-10508), aunque sin información de secuencia. La cepa ya no está disponible, ya que el depósito fue retirado.

DD 20043218 expone una preparación proteolítica derivada de una cepa de Nocardiopsis dassonvillei ZIMET 43647, aunque sin información de secuencia. La cepa ya no se encuentra disponible.

JP 2003284571-A, publicada después de la primera fecha de solicitud de la presente invención, expone la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN correspondiendo a una proteasa derivada de la especie Nocardiopsis TOA-1 (FERM P-18676). La secuencia ha sido introducida en GENESEQP con nº ADF43564.

Unas proteasas termoestables están descritas en la técnica anterior, por ejemplo una proteasa de Termomonospora fusca YX está descrita por Lao y Wilson en Appl. Environ. Microbiol. 62:4256-4259 (1996), y la secuencia fue depositada en las bases de datos públicas como sptrembl_086984. No obstante, esta proteasa no es homóloga de las proteasas de Nocardiopsis, ya que el porcentaje de identidad con las proteasas de la invención es inferior al 60%.

Mitsuiki Shinji et al (Bioscience Biotechnology and Biochemistry, vol. 66, no. 1, 2002, pp 164-167) revelan una proteasa alcalina no termoestable de la especie Nocardiopsis con una temperatura óptima de aproximadamente 70ºC.

EP-A-0506448 expone una proteasa de enzimogenes Lisobacter y de algunos mutantes de los mismos que pueden ser termoestables, no obstante el ADN de codificación presenta menos del 72% de identidad con los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº:1 y los nucleótidos 502-1065 de SEC ID Nº:11.

Un objeto de la presente invención es proporcionar proteasas termoestables que sean homólogas a las proteasas de Nocardiopsis, en particular con un potencial para su uso en alimentos para animales y/o detergentes.

Resumen de la invención

Varias proteasas termoestables fueron aisladas y caracterizadas, es decir una proteasa derivada de la especie Nocardiopsis dassonvillei, subespecie dassonvillei DSM 43235 (véase SEC ID Nº: 1 y 2); una Proteasa sintética 22 (véase SEC ID Nº: 7 y 8); una proteasa L2a derivada de la especie Nocardiopsis DSM 16424 (véase SEC ID Nºs: 9 y 10); y Proteasa 8 derivada de Nocardiopsis alba DSM 15647 (véase SEC ID Nºs: 11 y 12).

La invención expone un polipéptido aislado que posee una actividad proteasa, y que tiene una temperatura de fusión (T_m) de al menos 78ºC, determinada por Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) en un tampón de fosfato de sodio a 10 mM, cloruro de sodio a 50 mM, pH 7,0, usando un índice de barrido constante de 1,5ºC/min, donde el polipéptido es seleccionado del grupo consistente en: (a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que posee un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2 y/o 1 a 188 de SEC ID Nº: 12 de al menos 60%; (b) un polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que se hibridiza en condiciones de astringencia alta con cualquier nucleótido 499-1062 de SEC ID Nº: 1 y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11. y (c) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que tiene un grado de identidad para cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1 y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11 de al menos 72%. La invención también se refiere a secuencias de ácido nucleico aisladas codificantes de tales proteasas; constructos de ácido nucleico, vectores, y a células huéspedes comprendiendo las secuencias de ácido nucleico; así como a métodos para producir y usar las proteasas, en particular en alimentos para animales.

También están descritos aquí:

A. Un polipéptido aislado de la familia de peptidasas S2A y/o familia de peptidasas S1E que posee una actividad proteasa, y posee una secuencia amino comprendiendo al menos uno de los siguiente aminoácidos en la posición indicada: 10Y, 24S, 38T, 42G, 49T, 51T, 53Q, 54N, 82S, 86Q, 87S, 89T, 91T, 92S, 96A, 99A, 118N, 120T, 122R, 125Q, 129Y, 130S, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S, 166V, 171Y, 179I, y/o 186I; preferiblemente 10Y, 38T, 82S, 99A, 118N, 120T, 122R, 125Q, 129Y, 130S, 131L, 165S, y/o 171Y; más preferiblemente junto con al menos uno de 95P, 100V, y/o 1141; y/o en conjunto con (H35 + D61 + S143); donde cada posición corresponde a una posición de SEC ID Nº: 2;

B. El polipéptido de B que comprende al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 38T, 92S, 120T, 125Q, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S, y/o 171Y;

C. El polipéptido de A que comprende al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 10Y, 24S, 42G, 49T, 51T, 53Q, 54N, 82S, 86Q, 87S, 89T, 91T, 96A, 99A, 118N, 122R, 129Y, 130S, 166V, 179I, y/o 186I;

D. Un polipéptido aislado de la familia de peptidasas S2A y/o familia de peptidasas S1E que posee una actividad proteasa, y posee una secuencia amino comprendiendo a al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 25S, 38T, 42P, 44S, 49Q, 54R, 62S, 89S, 91S, 92S, 95A, 99Q, 100I, 114V, 120T, 125Q, 129Q, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S, 166F, 171Y, 176N, 179L, 180S, 184L, y/o 185T; preferiblemente 25S, 38T, 42P, 44S, 54R, 62S, 125Q, 131L, 165S, 171Y, 176N, 179L, 180S, 184L, y/o 185T; más preferiblemente en conjunto con al menos uno de 24A, 51V, 53E, 86A, 87T, 961, y/o 186L; y/o en conjunto con (H35 + D61 + S143); donde cada posición corresponde a una posición de SEC ID Nº: 12.

E. El polipéptido de D que comprende al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 38T, 92S, 120T, 125Q, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S, y/o 171Y.

F. El polipéptido de D que comprende al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 25S, 42P, 44S, 49Q, 54R, 62S, 89S, 91S, 95A, 99Q, 100I, 114V, 129Q, 166F, 176N, 179L, 180S, 184L, y/o 185T.

G. El polipéptido de cualquiera de A, B, C, D, E, y F que tiene una T_m de al menos 78ºC medida por DSC en fosfato de sodio a 10 mM de, cloruro de sodio a 50 mM, pH 7,0; y/o una actividad relativa con pH9 y 80ºC de al menos 0,40;

H. El polipéptido de cualquiera de A, B, C, D, E, F, y G que tiene un porcentaje de identidad de al menos 60% con cualquiera de los aminoácidos -166 a 188, preferiblemente 1-188, de SEC ID Nº: 2; aminoácidos -192 a 196, preferiblemente 1-196, de SEC ID Nº: 8; aminoácidos -195 a 189, preferiblemente 1-189 de SEC ID Nº: 10; y/o con los aminoácidos -167 a -1, preferiblemente 1-188, de SEC ID Nº: 12;

I. El polipéptido de cualquiera de A, B, C, D,... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado que posee una actividad proteasa, y que presenta una temperatura de fusión (T_m) de al menos 78ºC, determinada por calorimetría diferencial de barrido (DSC) en 10 mM de tampón de sodio, 50 mM de cloruro de sodio, pH 7,0, usando una velocidad de barrido constante de 1,5ºC/min, donde el polipéptido es seleccionado del grupo consistente en:

2. Polipéptido según la reivindicación 1 que

3. Polipéptido según la reivindicación 1 que

4. Ácido nucleico aislado comprendiendo un ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Ácido nucleico aislado comprendiendo un ácido nucleico que codifica un polipéptido que posee una actividad proteasa y una temperatura de fusión (T_m) de al menos 78ºC, determinada por calorimetría diferencial de barrido (DSC) en 10 mM de fosfato de sodio, 50 mM de tampón de cloruro de sodio, pH 7,0, usando una velocidad de barrido constante de 1,5ºC/min, donde el ácido nucleico

6. Ácido nucleico según la reivindicación 5 que

7. Ácido nucleico según la reivindicación 5 que

8. Constructo de ácidos nucléicos comprendiendo el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 4-7 enlazado operativamente con una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuada.

9. Vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico según la reivindicación 8.

10. Célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico de la reivindicación 8 o el vector de la reivindicación 9.

11. Método para la producción de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, método comprendiendo: (a) el cultivo de una célula huésped recombinante de la reivindicación 10 para producir un sobrenadante comprendiendo el polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

12. Planta, o parte de planta, transgénica capaz de expresar el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

13. Animal transgénico no humano, o productos, o elementos del mismo, capaces de expresar el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

14. Método para la producción de un polipéptido según la reivindicación 1, el método comprendiendo

15. Uso de al menos un polipéptido tal y como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3 (i) en alimentos para animales; (ii) en la preparación de una composición para usar en alimentos para animales; (iii) para mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales; (iv) para aumentar la proteína digerible y/o soluble en dietas de animales; (v) para aumentar el grado de hidrólisis de las proteínas en dietas de animales; y/o (vi) para el tratamiento de las proteínas.

16. Aditivo de alimentos para animales comprendiendo al menos un polipéptido tal y como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3. y

17. Composición de alimentos para animales que posee un contenido de proteínas brutas de 50 a 800 g/kg y comprendiendo al menos un polipéptido tal como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o al menos un aditivo de producto alimentario según la reivindicación 16.

18. Composición de alimentos para animales según la reivindicación 17 que es un producto alimentario para peces.

19. Composición comprendiendo al menos un polipéptido tal como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, con al menos otra enzima seleccionada entre una amilasa, fitasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa, y/o beta-glucanasa.

20. Uso de al menos un polipéptido tal como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en detergentes.

21. Especie Nocardiopsis DSM 16424.

22. Nocardiopsis alba DSM 15647.