VARIANTES DE PROTEASA.
Proteasa con un porcentaje de identidad de los aminoácidos 1 a 188 de una proteasa progenitora que consiste en SEC ID n.
º 2 de al menos 60%, que exhibe una termoestabilidad mejorada en comparación con la proteasa progenitora por determinación de actividad residual tras la incubación durante cuatro horas a 65ºC con pH 6 o pH 4 en un tampón Na2HPO4 0,2M y que comprende al menos una de las siguientes sustituciones: N47D, Q54R, N92K, y/o T127R, donde cada posición corresponde a una posición de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2; con la condición de que la proteasa no sea: los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 2, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 2 con la sustitución T87A, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 4, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 6, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 8, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 10, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 22, y no las partes maduras de las proteasas que tienen las secuencias de SEC ID n.º 23, SEC ID n.º 24, SEC ID n.º 25, SEC ID n.º 26, SEC ID n.º 27 y SEC ID n.º 28 y donde el grado de identidad entre secuencias se determina por el programa "align" usando la matriz de puntuación BLOSUM50, la penalización para el primer residuo de un espacio es -12 y las penalizaciones para otros residuos de un espacio son - 2
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/DK2004/000688.
Solicitante: NOVOZYMES A/S.
Nacionalidad solicitante: Dinamarca.
Dirección: KROGSHOJVEJ 36 2880 BAGSVAERD DINAMARCA.
Inventor/es: ANDERSEN, CARSTEN, STERGAARD, PETER, RAHBEK, DE MARIA,LEONARDO, CHRISTENSEN,LARS,LEHMANN HYLLING, LASSEN,Søren,Flensted.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 8 de Octubre de 2004.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N9/52 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › que provienen de bacterias.
- C12N9/58 C12N 9/00 […] › que provienen de hongos.
Clasificación PCT:
- A23J3/34 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A23 ALIMENTOS O PRODUCTOS ALIMENTICIOS; SU TRATAMIENTO, NO CUBIERTO POR OTRAS CLASES. › A23J COMPOSICIONES A BASE DE PROTEINAS PARA LA ALIMENTACION; TRATAMIENTO DE PROTEINAS PARA LA ALIMENTACION; COMPOSICIONES A BASE DE FOSFATIDOS PARA LA ALIMENTACION. › A23J 3/00 Tratamiento de proteínas para la alimentación. › utilizando enzimas.
- C12N15/57 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › que actúan sobre los enlaces peptídicos (3.4).
- C12N9/52 C12N 9/00 […] › que provienen de bacterias.
Clasificación antigua:
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre.
PDF original: ES-2358092_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Variantes de proteasa.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una estructura tridimensional de la proteasa nueva, al igual que variantes de una proteasa progenitora, en particular, variantes de propiedades enmendadas, tales como termoestabilidad mejorada y/o perfil de actividad de temperatura enmendada. La invención también se refiere a secuencias de ADN que codifican tales variantes, su producción en una célula huésped recombinante, al igual que métodos de uso de las variantes, en particular, en el campo de pienso para animales y detergentes. La invención además se refiere a métodos de generación y preparación de variantes de proteasa de propiedades enmendadas. Las proteasas progenitoras preferidas son proteasas de Nocardiopsis, tales como proteasas que comprenden las partes de péptido maduro de SEC ID n.os: 2, 4, 6, 8, 10 y 21.
Antecedentes de la invención
Las secuencias de proteasa derivadas de cepas de Nocardiopsis se describen en WO 88/03947, WO 01/58276 y DK 1996 00013 ("Proteasa 10", SEC ID n.os: 1-2).
JP 2003284571-A describe, como las SEC ID n.os: 2 y 1, la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN correspondiente, respectivamente, de una proteasa derivada de Nocardiopsis sp. TOA-1 (FERM P-18676). Las secuencias han sido introducidas en la base de datos GENESEQ como GENESEQP n.º ADF43564 y GENESEQN n.º ADF43563, respectivamente.
JP 2-255081-A describe una proteasa derivada de la cepa Nocardiopsis sp. OPC-210 (FERM P-10508), no obstante, sin información de secuencia. La cepa ya no está disponible, puesto que el depósito fue retirado.
DD 200432 8 describe una preparación proteolítica derivada de la cepa Nocardiopsis dassonvillei ZIMET 43647, no obstante, sin información de secuencia. La cepa parece ya no estar no disponible.
Se describen secuencias de proteasa de Nocardiopsis adicionales en PCT/DK04/000433 ("Proteasa 08" SEC ID n.os 9-10 en el presente documento); PCT/DK04/000434 ("Proteasa 11", SEC ID n.os: 5-6 en el presente documento); PCT/DK04/000432 ("Proteasa 18", SEC ID n.os 3-4 en el presente documento); y PCT/DK04/000435 ("Proteasa 35", SEC ID n.os 7-8 en el presente documento).
Es un objeto de la presente invención proporcionar proteasas alternativas, en particular, para el uso en pienso para animales y/o detergentes, en particular, variantes de proteasa mejoradas y nuevas, preferiblemente de propiedades enmendadas, tales como termoestabilidad mejorada y/o una temperatura óptima más alta o inferior.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a una variante de una proteasa progenitora, que comprende una sustitución en al menos una posición de al menos una región seleccionada del grupo de regiones que consisten en: 6-18, 22-28, 32-39, 42-58, 62-63, 66-76, 78-100, 103-106, 111-114, 118-131, 134-136, 139-141, 144-151, 155-156, 160-176, 179-181 y 184-188 donde
(a) la variante tiene actividad de la proteasa; y
(b) cada posición corresponde a una posición de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2 y
(c) la variante tiene un porcentaje de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2 de al menos 60%.
La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican la variante de proteasa y a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos al igual que métodos para producir y usar las variantes de la proteasa.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es una alineación múltiple de la proteasa 10, la proteasa 18, la proteasa 11, la proteasa 35 y la proteasa 08 (las partes de péptido maduro de SEC ID n.os 2, 4, 6, 8 y 10, respectivamente), que también incluye una variante de la proteasa de la invención, es decir, la proteasa 22 (aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 21);
La figura 2 proporciona las coordenadas de la estructura tridimensional nueva de la proteasa 10 (aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2) derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262.
Descripción detallada de la invención
Estructura tridimensional de la proteasa 10
La estructura de la proteasa 10 fue resuelta conforme a los principios para los métodos cristalográficos de rayos X según se ofrecen, por ejemplo, en X-Ray Structure Determination, Stout, G.K. y Jensen, L.H., John Wiley & Sons, Inc. NY, 1989. Las coordenadas estructurales para la estructura cristalina con una resolución de 2.2 A usando el método de sustitución isomorfa se presentan en la figura 2 en formato de PDB estándar (Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven, CT). El archivo PDB de la figura 2 se refiere a la parte de péptido maduro de la proteasa 10 correspondiente a los residuos 1-188 de SEC ID n.º 2.
Dinámica Molecular (DM)
Las simulaciones de la Dinámica Molecular (DM) son una indicación de la movilidad de los aminoácidos en una estructura de proteína (véase McCammon, JA y Harvey, SC., (1987), "Dynamics of proteins and nucleic acids", Cambridge University Press). Tal dinámica de las proteínas es frecuentemente comparada con los factores B cristalográficos (véase Stout, GH y Jensen, LH, (1989), "X-ray structure determination", Wiley). Al ejecutar la simulación de DM a, por ejemplo, temperaturas diferentes, se simula la movilidad relacionada con la temperatura de los residuos. Las regiones que tienen la movilidad o la flexibilidad máxima (en este caso, fluctuaciones isotrópicas) se pueden sugerir para mutagénesis aleatoria. Se entiende aquí que la alta movilidad encontrada en áreas determinadas de la proteína puede ser térmicamente mejorada substituyendo estos residuos.
Usando los programas CHARMM (Accelrys) y NAMD (Universidad de Ilinois en Urbana-Champaign), la estructura de la proteasa 10 anteriormente descrita fue sometida a DM a 300 y 400 K. Empezando a partir de las coordenadas de la figura 2, se construyó hidrógeno y átomos pesados faltantes usando los procedimientos de CHARMM HBUILD e IC BUILD, respectivamente. Luego, la estructura fue minimizada usando el procedimiento de minimización de Gradientes conjugados CHARMM (CONJ) para un total de 200 pasos. La proteína luego fue colocada en una caja de 70 X 70 X 70 Angstrom y disuelta con moléculas de agua TIP3. Se agregó un total de 11124 moléculas de agua y luego fueron minimizadas, manteniendo fijas las coordenadas de proteína, usando el procedimiento de minimización Adopted Basis Newton Raphson (ABNR) de CHARMM para 20000 pasos. El sistema luego fue calentado a la temperatura deseada a razón de 1 K cada 100 pasos usando el software NAMD. Después de un equilibrado de 50 picosegundos, se realizó una DM de conjunto NVE durante 1 nanosegundo. Ambos pasos se realizaron con el software NAMD. Se utilizó un corte de 12 Angstrom para las interacciones no ligadas. Las condiciones límites periódicas se utilizaron después del paso de disolución y para todos los posteriores. La fluctuaciones isotrópicas de valor medio cuadrado (VMC) se calcularon con el procedimiento COOR DYNA de CHARMM.
Las siguientes regiones para mutagénesis sugeridas surgen de simulaciones de DM: del residuo 160 al 170, del residuo 78 al 90, del residuo 43 al 50, del residuo 66 al 75, y del residuo 22 al 28.
Estrategia para preparar variantes
Las regiones de residuos de aminoácidos, al igual que las sustituciones de aminoácido individuales, fueron sugeridas para mutagénesis sobre la base de la estructura tridimensional de la figura 2 y la alineación de las cinco proteasas conocidas (las cinco filas superiores de la figura 1), principalmente, con el propósito de mejorar la termoestabilidad.
Las siguientes regiones fueron sugeridas, cf. reivindicación 1: 6-18, 22-28, 32-39, 42-58, 62-63, 66-76, 78-100, 103-106, 111-114, 118-131, 134-136, 139-141, 144-151, 155-156, 160-176, 179-181 y 184-188.
Al menos una de las siguientes posiciones de las regiones anteriores son preferiblemente sometidas a mutagénesis, cf. reivindicación 3, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 16, 17, 18, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 32, 33, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 62, 63, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 103, 105, 106, 111, 113, 114, 118,... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Proteasa con un porcentaje de identidad de los aminoácidos 1 a 188 de una proteasa progenitora que consiste en SEC ID n.º 2 de al menos 60%, que exhibe una termoestabilidad mejorada en comparación con la proteasa progenitora por determinación de actividad residual tras la incubación durante cuatro horas a 65ºC con pH 6 o pH 4 en un tampón Na2HPO4 0,2M y que comprende al menos una de las siguientes sustituciones: N47D, Q54R, N92K, y/o T127R, donde cada posición corresponde a una posición de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2;
con la condición de que la proteasa no sea:
los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 2, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 2 con la sustitución T87A, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 4, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 6, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 8, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 10, los aminoácidos 1-188 de SEC ID n.º 22, y no las partes maduras de las proteasas que tienen las secuencias de SEC ID n.º 23, SEC ID n.º 24, SEC ID n.º 25, SEC ID n.º 26, SEC ID n.º 27 y SEC ID n.º 28 y donde el grado de identidad entre secuencias se determina por el programa "align" usando la matriz de puntuación BLOSUM50, la penalización para el primer residuo de un espacio es -12 y las penalizaciones para otros residuos de un espacio son -2.
2. Proteasa según la reivindicación 1 que tiene la secuencia de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 2 salvo al menos una sustitución seleccionada de los siguientes: N47D, Q54R, N92K y/o T127R.
3. Proteasa según la reivindicación 1 que tiene la secuencia de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 4 salvo al menos una sustitución seleccionada de los siguientes: N47D, N54R, S92K y/o T127R.
4. Proteasa según la reivindicación 1 que tiene la secuencia de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 6 salvo al menos una sustitución seleccionada de los siguientes: N47D, Q54R, N92K y/o T127R.
5. Proteasa según la reivindicación 1 que tiene la secuencia de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 8 salvo al menos una sustitución seleccionada de los siguientes: N47D, Q54R, N92K y/o T127R.
6. Proteasa según la reivindicación 1 que tiene la secuencia de aminoácidos 1 a 188 de SEC ID n.º 10 salvo al menos una sustitución seleccionada de los siguientes: N47D, S92K y/o T127R.
7. Proteasa según la reivindicación 2 que se selecciona de los siguientes:
8. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 8 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la variante de proteasa en un huésped de expresión adecuado.
10. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 9.
11. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 9 y/o el vector de expresión según la reivindicación 10.
12. Método para la producción de la proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el método comprendiendo:
(a) cultivar la célula huésped según la reivindicación 11 para producir un sobrenadante que comprende la proteasa; y
(b) recuperar la proteasa.
13. Planta transgénica, o parte de la planta, capaz de expresar una proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
14. Animal transgénico no humano, o productos, o elementos de los mismos, que sean capaces de expresar una proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
15. Aditivo de pienso que comprende al menos una proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y
(a) al menos una vitamina liposoluble;
(b) al menos una vitamina hidrosoluble y/o
(c) al menos un oligoelemento.
16. Composición de pienso para animales con un contenido de proteína bruta de 50 a 800 g/kg y que comprende la proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
17. Método para mejorar el valor nutritivo de un pienso para animales, donde la proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y/o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16 se añade al pienso.
18. Método para el tratamiento de proteínas, que comprende el paso de añadir la proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y/o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 15-16 a al menos una proteína o fuente de proteína.
19. Uso de la proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y/o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 15-16 (i) en pienso para animales; (ii) en la preparación de pienso para animales; (iii) para mejorar el valor nutritivo de pienso para animales; y/o (iv) para el tratamiento de proteínas.
20. Uso de la proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en detergentes.
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