POLIPEPTIDOS CON ACTIVIDAD PROTEASA Y ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LOS MISMOS.
Polipéptido aislado que tiene una actividad de proteasa, seleccionado en el grupo que consiste en:
(a)un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad con respecto a los aminoácidos -178 a 177; -159 a 177, o +1 a 177 de SEC N.º ID:2 de al menos 80%;
(b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibridiza en condiciones de astringencia media con
(i) la proteasa madura codificante de una parte del plásmido contenido en Escherichia coli DSM 14652,
(ii) los nucleótidos 25 a 1089, 1 a 1089, 1 a 1344, 25 a 1344, 559 a 1344, o 559 a 1089 de SEC N.º ID:1,
(iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos, o
(iv) una cadena complementaria de (i), (ii) o (iii); y
(c) un fragmento de (a) o (b) que tiene una actividad de proteasa
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/DK02/00824.
Solicitante: NOVOZYMES A/S.
Nacionalidad solicitante: Dinamarca.
Dirección: KROGSHØJVEJ 36,2880 BAGSVAERD.
Inventor/es: TANG,LAN, WU,WENPING,ROOM 103,ER DAN YUAN IN BLDG NO. 3, HATZACK,FRANK.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 18 de Noviembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N9/58 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › que provienen de hongos.
Clasificación PCT:
Clasificación antigua:
Fragmento de la descripción:
Polipéptidos con actividad proteasa y ácidos nucleicos que codifican los mismos.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una actividad de proteasa y secuencias de ácidos nucleicos aisladas codificante de polipéptidos. La invención se refiere también a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos así como métodos de producción y de uso de los polipéptidos.
La clonación del gen de penicilolisina (plnC) a partir de una cepa de Penicillium citrinum está descrita por Matsumoto et al en Biochim. Biophys. Acta 1218:469 (1994). La secuencia fue expuesta en la base de datos EMBL como D25535.
WO 97/46689 expone las secuencias (codificantes) de proteasa siguientes a partir de cepas de Aspergillus específicas:
SEC N.º ID:1 de WO 97/46689 es un gen parcial de Aspergillus niger pepH;
SEC N.º ID:2 de WO 97/46689 es un ADNc parcial de Aspergillus niger pepH;
SEC N.º ID:3 de WO 97/46689 es una secuencia parcial de aminoácidos de Aspergillus niger PEPH;
SEC N.º ID:4 de WO 97/46689 es un gen de Aspergillus nidulans pepI;
SEC N.º ID:5 de WO 97/46689 es un ADNc de Aspergillus nidulans pepI; y
SEC N.º ID:6 de WO 97/46689 es una secuencia de aminoácidos de Aspergillus nidulans PEPI.
In Gene 165(1): 121-125 (1995), Ramesh et al revelan la clonación y la caracterización de los genes codificantes de proteasas a partir de una cepa de Aspergillus flavus y una cepa de Aspergillus fumigatus. Estas secuencias fueron expuestas en EMBL como L7524 y U24146, respectivamente.
La secuencia de una proteasa neutra variante basada en la proteasa neutra II de una cepa de Aspergillus oryzae está descrita en JP 05-168479. La clonación de la proteasa neutral madre de Aspergillus oryzae II está descrita en Mol. Gen, Genet. (1991), 228, p. 97-103 por Hiroki Tatsumi et al.
Las partes del péptido maduro de las proteasas mencionadas más arriba tienen un grado de identidad en la parte de péptido maduro de una proteasa Thermoascus de la presente invención del 75,7% o inferior.
Las secuencias de nucleótidos correspondientes a las partes del péptido maduro de las proteasas mencionadas más arriba tienen un grado de identidad en la secuencia de nucleótidos correspondiente a la parte del péptido maduro de una proteasa Thermoascus de la presente invención del 68,4% o inferior.
WO99/34003 revela una metaloproteasa y su uso en alimentos para animales.
Un objeto de la presente invención consiste en proveer proteasas alternativas con un potencial para su uso en alimentos para animales.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una actividad de proteasa seleccionados en el grupo que consiste en:
La SEC N.º ID:1 es una secuencia de ADNc de una proteasa de Thermoascus aurantiacus CGMCC n.º 0670 (SEC N.º ID:1); y la SEC N.º ID:2 es su secuencia de aminoácidos deducida.
La presente invención se refiere también a secuencias de ácidos nucleicos aisladas codificantes de los polipéptidos y a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes comprendiendo las secuencias de ácidos nucleicos así como a métodos para la producción y el uso de los polipéptidos, en particular en la alimentación para animales.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra los resultados de una prueba de inhibición en una proteasa de Thermoascus aurantiacus CGMCC n.º 0670;
La figura 2 muestra el perfil de temperatura de ésta;
La figura 3 muestra el perfil de pH de ésta;
La figura 4 muestra la estabilidad de pH de ésta; y
La figura 5 muestra los resultados de una prueba de la especificidad de sustrato de ésta.
Descripción detallada de la invención
Los inventores han identificado de manera sorprendente una nueva clase de proteasas que pueden ser útiles en la alimentación para animales. La mayoría de las proteasas de alimentos conocidos son proteasas de serina, y muchas de éstas no son suficientemente estables al ácido para sobrevivir al paso a través del estómago ácido. Las proteasas de la invención se relacionan con una metaloproteasa estable en ácido derivada de Thermoascus aurantiacus. La parte de polipéptido maduro de esta proteasa comprende aminoácidos 1-177 de SEC N.º ID:2. Estudios in vitro que simulan la digestión en animales monogástricos y peces han demostrado que la proteasa de Thermoascus aurantiacus es capaz de aumentar la cantidad de proteína soluble y digerible y de aumentar el grado de hidrólisis de proteína. Un nuevo polipéptido homólogo fue identificado en Aspergillus oryzae (aminoácidos 177-353 de SEC N.º ID:11).
Polipéptidos con una actividad de proteasa
Las proteasas a veces también son peptidasas designadas, proteinasas, hidrolasas de péptidos, o enzimas proteolíticas. Las proteasas pueden ser del tipo exo que hidroliza péptidos comenzando en cualquier de sus extremos, o del tipo endo que actúan internamente en cadenas de polipéptidos (endopeptidasas). Las endopeptidasas muestran una actividad en sustratos de péptidos bloqueados C-terminales y N-terminales que son relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión.
El término "proteasa" es definido aquí como una enzima que hidroliza enlaces peptídicos. Ésta incluye cualquier enzima del grupo enzimático EC 3.4 (incluyendo cada una de sus trece subclases). El número EC se refiere a Enzyme Nomenclature 1992 (nomenclatura de las enzimas) de NC-IUBBM, Academic Press, San Diego, California, incluyendo los suplementos 1-5 publicados en Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; y Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente. La nomenclatura es completada y actualizada regularmente; véase, por ejemplo la World Wide Web (WWW) en http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.htm).
Las proteasas son clasificadas en base a sus mecanismos catalíticos en los grupos siguientes: proteasas de serina (S), proteasas de cisteína (C), proteasas aspárticas (A), metaloproteasas (M), y proteasas desconocidas, o no clasificadas aún (U), véase Handbook of Proteolytic Enzymes (Manual de Enzimas Proteolíticas), A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Academic Press (1998), en particular la parte de introducción general.
En formas de realización particulares, las proteasas de la invención son seleccionadas en el grupo que consiste en:
Reivindicaciones:
1. Polipéptido aislado que tiene una actividad de proteasa, seleccionado en el grupo que consiste en:
2. Polipéptido según la reivindicación 1 que se define como
3. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que
4. Constructo de ácidos nucleicos comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 3 enlazada operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.
5. Vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos según la reivindica- ción 4.
6. Célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 4 o el vector según la reivindicación 5.
7. Método de producción de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, método comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped recombinante según la reivindicación 6 para producir un sobrenadante comprendiendo el polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
8. Método de producción de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, método comprendiendo (a) el cultivo de una cepa del género Thermoascus; y (b) la recuperación del polipéptido.
9. Thermoascus aurantiacus CGMCC N.º 0670.
10. Uso de la proteasa según la reivindicación 1 o 2
11. Método para mejorar el valor nutritivo de una alimento para animales, donde la proteasa según la reivindicación 1 o 2 es añadida al alimento.
12. Aditivo de alimentos para animales comprendiendo
el aditivo comprendiendo opcionalmente también, fitasa, xilanasa, galactanasa, y/o beta-glucanasa.
13. Composición de alimentos para animales con un contenido de proteínas brutas de 50 a 800 g/kg y comprendiendo la proteasa según la reivindicación 1 o 2.
14. Método de tratamiento de proteínas vegetales, comprendiendo la fase de adición de la proteasa según la reivindicación 1 o 2 por lo menos a una proteína vegetal o a una fuente de proteína vegetal.
15. Método según la reivindicación 14, donde se incluye la soja en dicha al menos una fuente de proteína vegetal.
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