Procedimiento para producir L- arginina utilizando una bacteria de la familia de las enterobacteriáceas, que presenta una expresión atenuada de un gen codificante de un transportador de la L- arginina.
Procedimiento para producir L-arginina, que comprende:
- cultivar una bacteria productora de L-arginina de la familia de las enterobacteriáceas en un medio,
y
- recoger la L-arginina del medio, en el que dicha bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del genartI mediante la inactivación del gen artI.
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09015195.
Solicitante: AJINOMOTO CO., INC..
Nacionalidad solicitante: Japón.
Dirección: 15-1, KYOBASHI 1-CHOME CHUO-KU TOKYO, 104-8315 JAPON.
Inventor/es: GUSYATINER, MIKHAIL MARKOVICH, ROSTOVA, YULIA GEORGIEVNA, VOROSHILOVA,ELVIRA,BORISOVNA, KIRYUKHIN,MIKHAIL YURIEVICH.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12P13/10 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Citrulina; Arginina; Ornitina.
PDF original: ES-2402191_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimiento para producir L-arginina utilizando una bacteria de la familia de las enterobacteriáceas, que presenta una expresión atenuada de un gen codificante de un transportador de la L-arginina.
Antecedentes de la invención
Campo técnico La presente invención se refiere a la industria microbiológica, y específicamente a un procedimiento para producir L-arginina. El procedimiento utiliza una bacteria de la familia de las enterobacteriáceas, que ha sido modificado para atenuar la expresión de uno o varios genes codificantes de un transportador de la L-arginina.
Descripción de la técnica relacionada Convencionalmente, los L-aminoácidos se han producido industrialmente mediante procedimientos de fermentación utilizando cepas de microorganismos de fuentes naturales, o mutantes de los mismos. Típicamente, los microorganismos se modifican para incrementar los rendimientos de producción de L-aminoácidos diana.
Se han publicado muchas técnicas para incrementar los rendimientos de producción de L-aminoácidos, incluyendo la transformación de microorganismos con ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.278.765) . Entre otras técnicas para incrementar los rendimientos de producción se incluyen incrementar las actividades de enzimas que participan en la biosíntesis de los aminoácidos y/o desensibilizar los enzimas diana respecto a la inhibición por retroalimentación por el L-aminoácido producido (ver, por ejemplo, el documento WO 95/16042 o las patentes US nº 4.346.170, nº 5.661.012 y nº 6.040.160) .
Otras maneras de incrementar los rendimientos de producción de L-aminoácidos son atenuar la expresión de uno o varios genes que participan en la degradación del L-aminoácido, genes que desvían los precursores del L-aminoácido diana de la ruta biosintética de L-aminoácidos, genes implicados en la redistribución de los flujos de carbono, nitrógeno y fosfato, y genes codificantes de toxinas, etc.
Un sistema de transporte dependiente de una proteína de unión en Escherichia coli específica para la L-arginina se caracterizó por medios genéticos y bioquímicos. El sistema está formado de cinco genes contiguos, artPIQMJ ("art" se refiere al transporte de arginina) , que se organizan en dos unidades transcripcionales (artPIQM y artJ) . Los productos de los genes artI y artJ, ArtI y ArtJ, son proteínas de unión periplasmáticas con similitud de secuencia con proteínas de unión para aminoácidos polares o básicos. Los productos de artQ, artM y artP son similares a las proteínas transmembranales conocidas y la ATPasa de los portadores dependientes de proteína de unión. Las proteínas ArtI y ArtJ maduras se localizan en el periplasma y no presentan un péptido de señal de 19 residuos aminoácidos. ArtI y ArtJ se aíslan de cepas sobreproductoras. ArtJ se une específicamente a L-arginina con elevada afinidad y la sobreproducción de ArtJ estimula la incorporación de L-arginina por parte de las bacterias. No se conoce cuál es el sustrato para ArtI y la proteína ArtI aislada no se une a los aminoácidos comunes, a diversos aminoácidos no comunes básicos ni a aminas. Se ha concluido que los genes artPIQM artJ codifican un tercer sistema de incorporación de la arginina, además del sistema conocido argT hisJQMP de Salmonella typhimurium y
E. coli y el portador arginina (-ornitina) (aps) de E. coli (Wissenbach U. et al., Mol. Microbiol. 17 (4) :675-86, (1995) .
Sin embargo, actualmente no existen publicaciones de atenuación de la expresión de un gen codificante de un transportador de la L-arginina para la producción de L-arginina.
El documento EP 1 829 965 A1 da a conocer una lista de genes, entre ellos el gen artI, que pueden delecionarse en mutantes de E. coli para producir sustancias útiles, entre ellas la L-arginina.
El documento WO 2007/013639 A1 da a conocer un procedimiento para producir L-arginina utilizando Escherichia coli en el que se ha atenuado el gen cpxR.
Sumario de la invención La presente invención incluye incrementar la productividad de las cepas productoras de L-arginina y proporcionar un procedimiento para producir ácido L-arginina utilizando dichas cepas.
La presente invención proporciona lo siguiente:
[1] un procedimiento para producir L-arginina, que comprende:
-cultivar una bacteria productora de L-arginina de la familia de la enterobacteriáceas en un medio, y
-recoger L-arginina a partir del medio, en el que dicha bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del gen artI mediante inactivación del gen artI.
[2] El procedimiento según [1], en el que dicho gen artI codifica una proteína que presenta una homología no inferior a 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos completa SEC ID nº 4.
[3] El procedimiento según [1], en el que dicha bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del complejo artPIQM-artJ.
[4] El procedimiento según [3], en el que se ha atenuado la expresión del complejo artPIQM-artJ mediante inactivación del complejo artPIQM-artJ.
[5] El procedimiento según cualquiera de [1] a [4], en el que dicha bacteria pertenece al género Escherichia.
[6] El procedimiento según cualquiera de [1] a [4], en el que dicha bacteria pertenece al género Pantoea.
[7] El procedimiento según [5], en el que dicha bacteria es Escherichia coli. A continuación se describe en detalle la presente invención.
Breve descripción de los dibujos La figura 1 muestra las posiciones relativas de las parejas de cebadores P1 y P2, y P5 y P6 en el plásmido pMW118-attL-Cm-attR.
La figura 2 muestra la construcción del fragmento de ADN cromosómico que comprende el gen artI inactivado o el complejo artPIQM-artJ.
Descripción detallada de las formas de realización ejemplificativas
1. Bacteria utilizada en la presente invención La bacteria es una bacteria productora de L-arginina de la familia de las enterobacteriáceas, en la que la bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión de uno o varios genes codificantes de un transportador de la L-arginina.
La expresión "bacteria productora de L-arginina" se refiere a una bacteria que es capaz de producir y secretar L-arginina al medio, durante el cultivo de la bacteria en el medio.
La expresión "bacteria productora de L-arginina" también puede referirse a una bacteria que es capaz de producir y provocar la acumulación de la L-arginina en un medio de cultivo en una cantidad superior a la de una cepa de tipo salvaje o parental de una bacteria de la familia de las enterobacteriáceas, por ejemplo E. coli, tal como E. coli K12, y preferentemente se refiere a que la bacteria es capaz de provocar la acumulación en el medio de una cantidad no inferior a 0, 5 g/l, más preferentemente no inferior a 1, 0 g/l, de L-arginina.
La familia de las enterobacteriáceas incluye bacterias pertenecientes a los géneros Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella y Yersinia, etc. Específicamente, pueden utilizarse aquéllas clasificadas como enterobacteriáceas según la taxonomía utilizada en la
base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi? id=91347) . Resulta preferida una bacteria que
pertenezca al género Escherichia o Pantoea.
La expresión "una bacteria perteneciente al género Escherichia" se refiere a que la bacteria se clasifica en el género Escherichia según la clasificación conocida por el experto en el campo de la microbiología. Un ejemplo de una bacteria perteneciente al género Escherichia es, aunque sin limitarse a ella, Escherichia coli (E. coli) .
La bacteria perteneciente al género Escherichia no se encuentra particularmente limitada; sin embargo, se encuentran comprendidas, por ejemplo, las bacterias indicadas por Neidhardt F.C. et al. (Escherichia coli y Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabla 1) .
La expresión "una bacteria perteneciente al género Pantoea" se refiere a que la bacteria se clasifica como del género Pantoea según la clasificación conocida por el experto en el campo de la microbiología. Algunas especies de Enterobacter agglomerans se han reclasificado recientemente como Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Panttoea stewartii o similar basándose en el análisis de la secuencia de nucleótidos del ARNr 16S, etc.
La expresión "bacteria que ha sido modificada para atenuar la expresión de uno o varios genes codificantes de un transportador de la L-arginina" puede referirse a que la bacteria ha sido modificada de manera que... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para producir L-arginina, que comprende:
- cultivar una bacteria productora de L-arginina de la familia de las enterobacteriáceas en un medio, y
- recoger la L-arginina del medio, en el que dicha bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del gen artI mediante la inactivación del gen artI.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho gen artI codifica una proteína que presenta una homología no inferior a 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos entera de SEC ID nº 4.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha bacteria ha sido modificada para atenuar la expresión del complejo artPIQM-artJ.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la expresión del complejo artPIQM-artJ se atenúa mediante la inactivación del complejo artPIQM-artJ.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha bacteria pertenece al género Escherichia.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha bacteria pertenece al género Pantoea.
7. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha bacteria es la Escherichia coli.
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