Proceso para la preparación de clorinas y sus usos farmaceúticos.

Un procedimiento para sintetizar un derivado de clorina o bacterioclorina que tiene la siguiente fórmula:

**Fórmula**

en la que :

**Fórmula**

representa un enlace carbono-carbono simple o doble ;

X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 son cada uno, halógenos (F, Cl, Br) y átomos de hidrógeno seleccionados independientemente, siempre que simultáneamente X2, X4, X6, y X8 o que simultáneamente X1, X3, X5 y X7 sean halógenos, o que todos los X sean halógenos ;

R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 se seleccionan independientemente entre H, -OH y -SO2R, en el que cada R se selecciona independientemente entre - Cl, -OH, -aminoácido, -ORn, -NHRn y -NR2n -, donde Rn es un alquilo con 1 a 12 átomos de carbono;

Y es un átomo de flúor o hidrógeno;

incluyendo el paso siguiente:

(i) La reducción en estado sólido de la porfirina substituida correspondiente en derivado y clorina o de bacterioclorina usando hidrazidas en ausencia de disolventes y opcionalmente en ausencia de bases;

en el que la porfirina sustituida correspondiente tiene la fórmula : **Fórmula**

Proceso para la preparación de clorinas y sus usos farmaceúticos

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe métodos de preparación, las propiedades y la composición farmacéutica para uso en terapia de clorinas y bacterioclorinas sulfonadas concebidas para la terapia fotodinámica (PDT, siglas en inglés de Photodynamic therapy) de los tejidos hiperproliferativos, tales como tumores, vasos sanguíneos hiperproliferativos y otros trastornos o anomalías que responden a la PDT. En particular, la presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la síntesis química a gran escala de clorinas y bacterioclorinas estables, que se caracteriza por la ausencia de disolventes y la ausencia de bases.

I.FUNDAMENTOS DE LA INVENCIÓN

I.A. Estado actual de la técnica Varios compuestos macrocíclicos tetrapirrólicos, tales como las purpurinas, clorinas, bacterioclorinas, ftalocianinas y benzoclorinas pueden acumularse preferentemente en los tejidos hiperproliferativos cuando se inyectan en un organismo y absorben la luz, originando un estado activado en respuesta a la luz. Estos compuestos macrocíclicos presentan entonces un efecto citotóxico en las células donde se encuentran otros tejidos que han sido irradiados con la longitud de onda apropiada. Además, estos compuestos emiten también energía a partir del tejido, fenómeno que puede utilizarse para detectar su ubicación.

En PDT, se le inyecta al paciente un fotosensibilizador (por lo general a una concentración de 0, 1 a 10 mg/kg de peso corporal) , que presenta una cierta selectividad para causar daños fotoquímicos al tejido tumoral, y después de un tiempo determinado, se irradia la zona del tumor con luz visible o de la gama de infrarrojos cercana (aproximadamente 50 a 200 J/cm2) . El fotosensibilizador absorbe la luz y emite fluorescencia, o reacciona con las moléculas presentes en los tejidos por medio de reacciones de transferencia de electrones o hidrógeno (procesos de Tipo I) , o transfiere su energía al oxígeno molecular al estado fundamental generando oxígeno singlete O2 (1Δg) que ataca los tejidos (proceso de Tipo II) . El principal contribuyente para el proceso de Tipo I es el ión superóxido (O2 -) , formado por la transferencia de electrones que proceden del sensibilizador excitado electrónicamente. Existen pruebas a favor del proceso de foto-oxigenación Tipo II en relación al proceso Tipo I en células [1, 2], pero existen informes de aumento de la respuesta en PDT cuando también se genera el ión superóxido [3]. En caso de detección, la fluorescencia se determina por la exposición a la luz de la longitud de onda deseada, necesitando energías más bajas que aquellas utilizadas en el tratamiento. Generalmente, un tratamiento eficaz requiere la formación de grandes cantidades de oxígeno singlete en el tejido, que puede tener un efecto sinérgico con la formación simultánea de iones superóxidos u otras especies reactivas de oxígeno.

Las propiedades ideales de los sensibilizadores para su aplicación en PDT incluyen: (i) síntesis simple, eficiente y económica, (ii) estabilidad, la pureza y larga duración de almacenamiento, (iii) solubilidad en soportes o disolventes biocompatibles, (iv) coeficiente elevado de absorción en la "ventana fototerapéutica" (600-900 nm) , (v) sensibilización de oxígeno molecular singlete y/o generación de iones superóxidos de alto rendimiento cuántico; (vi) toxicidad reducida o inexistente en ausencia de luz, (vii) acumulación selectiva y retención prolongada en los tejidos tumorales, (viii) baja fotosensibilidad de la piel bajo administración sistémica, (ix) fotoblanqueo controlado, (x) fácil metabolismo o excreción después del tratamiento. El sensibilizador sólo es el precursor de las especies citotóxicas, que incluye especialmente el oxígeno singlete y otras especies reactivas de oxígeno, tales como el ión superóxido. El precursor inmediato del oxígeno singlete y, a menudo, de iones superóxidos es el estado triplete del sensibilizador. Por lo tanto, para obtener un alto rendimiento cuántico de oxígeno singlete, o estado triplete del sensibilizador debe tener por lo menos tres propiedades: (i) rendimiento cuántico cercano a la unidad, (ii) energía electrónica de al menos 20 kJ/mol superior al oxígeno singlete (94 kJ/mol) y (iii) vida de larga duración (centenares de microsegundos) . Se puede aumentar la acumulación y retención en los tejidos tumorales utilizando vectores específicos, pero una propiedad intrínseca pertinente del sensibilizador para tales fines es la hidrofilia/lipofilia del sensibilizador, y la capacidad de adaptar dichas propiedades para lograr los objetivos deseados es una propiedad muy apreciada.

El límite inferior de la ventana fototerapéutica se determina por la presencia de proteínas que contienen el grupo hemo, responsable en su mayoría de la absorción de la luz en la gama del espectro visible en los tejidos. La penetración de la luz en los tejidos disminuye rápidamente por debajo de 550 nm. Sin embargo, existe un aumento significativo en la penetración de 550 a 630 nm, que se duplica de nuevo a 700 nm. A esto, sigue un aumento del 10 % en la penetración del tejido a medida que la longitud de onda se desplaza hacia 800 nm. El límite superior de

la ventana fototerapéutica se determina por la absorción de la radiación de infrarrojos según las necesidades de agua y de energía para la transferencia eficiente de energía al oxígeno. De hecho, la transferencia de energía triplete controlada por difusión desde el sensibilizador para el oxígeno molecular requiere que la energía triplete del sensibilizador sea al menos de 115 kJ/mol. Además, el despliegue de energía singlete-triplete en compuestos macrocíclicos tetrapirrólicos es aprox. de 40 kJ/mol [4], que requiere que el sensibilizador tenga una energía singlete superior a 150 kJ/mol. Teniendo en cuenta que el desplazamiento de Stokes de estos sensibilizadores es generalmente pequeño, deberían absorber la luz por debajo de 800 nm. La conclusión es que un sensibilizador ideal debe absorber intensamente la luz de longitud de onda cercana a 750 nm. La fuerte absorción de bacterioclorinas en esta longitud de onda las hace candidatas ideales para los sensibilizadores en PDT. Para las aplicaciones en las que la penetración de la luz no es tan crítica, las clorinas también son candidatas adecuadas para su utilización en PDT.

Photofrin®, un derivado de hematoporfirina [5], es el fotosensibilizador más ampliamente utilizado y ha sido aprobado para el tratamiento de una variedad de tumores sólidos [6]. El derivado de hematoporfirina (HpD) se prepara mezclando la hematoporfirina con ácido acético glacial y ácido sulfúrico después de la hidrólisis y la precipitación en condiciones ácidas. Este método fue descrito parcialmente por Lipson et al. [7]. El HpD producido de esta manera es una mezcla compleja de porfirinas. Cuando el HpD se separa en sus dos fracciones principales por filtración en gel utilizando Sephadex LH-20, la porción con mayor peso molecular, denominada Photofrin ®, es un agente más eficaz en PDT [8]. La dosis de Photofrin® recomendada en humanos es de 1-2 mg/kg de peso corporal. Los principales componentes de Photofrin® son dímeros y oligómeros de elevado peso molecular, unidos entre sí por el tipo de éter, éster y posiblemente carbono-carbono [9].

Photofrin® tiene ciertas características deseables, incluyendo una buena eficiencia, solubilidad en agua, rendimiento razonable de oxígeno singlete y facilidad de fabricación. No obstante, Photofrin® también tiene desventajas: (i) está compuesto de una mezcla compleja de dímeros de porfirina y oligómeros de elevado peso molecular, unidos entre sí por el tipo de éter, éster y / o carbono-carbono; (ii) muestra la fototoxicidad en la piel del paciente en las cuatro a seis semanas después de la administración; (iii) debido a su absorción relativamente débil en la gama del rojo (630 nm) y una falta de penetración de la luz a través de los tejidos, el uso actual de Photofrin® en clínica en el ámbito de aplicación de PDT está limitado a la destrucción del tejido canceroso situado a menos de 4 mm de la fuente de luz utilizada en la terapia. Así pues, se necesitan sensibilizadores más eficaces, químicamente puros, menos fototóxicos, que muestren una mejor ubicación y que absorban la luz con mayor intensidad en los infrarrojos.

Es conocido en la materia que la reducción química de los anillos tetrapirrólicos, que corresponde a la transformación de una porfirina en una clorina, provoca el desplazamiento de la banda de absorción de mayor longitud de onda hacia el rojo, al mismo tiempo que provoca el aumento de su coeficiente de absorción. Estas propiedades... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para sintetizar un derivado de clorina o bacterioclorina que tiene la siguiente fórmula:

Fórmula (I) 5 en la que : representa un enlace carbono-carbono simple o doble ;

X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 son cada uno, halógenos (F, Cl, Br) y átomos de hidrógeno seleccionados independientemente, siempre que simultáneamente X2, X4, X6, y X8 o que simultáneamente X1, X3, X5 y X7 sean halógenos, o que todos los X sean halógenos ;

R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 se seleccionan independientemente entre H, -OH y -SO2R, en el que cada R se selecciona independientemente entre - Cl, -OH, -aminoácido, -ORn, -NHRn y -NR2n -, donde Rn es un alquilo con 1 a 12 átomos de carbono;

Y es un átomo de flúor o hidrógeno;

incluyendo el paso siguiente:

(i) La reducción en estado sólido de la porfirina substituida correspondiente en derivado y clorina o de bacterioclorina usando hidrazidas en ausencia de disolventes y opcionalmente en ausencia de bases; en el que la porfirina sustituida correspondiente tiene la fórmula :

Fórmula (II) .

2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1 para la síntesis de un derivado de clorina o de bacterioclorina con la siguiente fórmula:

Fórmula (III) 5 en la que : representa un enlace carbono-carbono simple o doble; X2 se seleccionan a partir de halógenos (F, Cl, Br) , X1 se selecciona entre hidrógeno o halógeno (F, Cl, Br) y R' son -SO2R;

R se seleccionan cada uno independientemente entre - Cl, -OH, -aminoácido, -ORn, -NHRn y -NR2n, donde Rn es un 10 radical alquilo que tiene de 1 a 12 átomos de carbono;

incluyendo el siguiente paso:

(i) La reducción en estado sólido de la porfirina substituida correspondiente en derivado de clorina o de bacterioclorina usando hidrazidas en ausencia de disolventes y opcionalmente en ausencia de bases, en el que la porfirina substituida correspondiente tiene la fórmula:

15

Fórmula (IV) .

40

600 650 700 750 800 850 900 λ (nm)

Figura 1

300 400 500 600 700 800 λ (nm)

Figura 2

Figura 3 Figura 4

Figura 5

Figura 6

01234567 Intensidad del láser (mJ/pulso)

Figura 7 Figura 8

Tiempo de irradiación (min)

Fracción de células supervivientes con luz

Dosis de luz (J/cm2)

Figura 9

Tiempo de irradiación (min) 0 5 10 1520

Fracción de células supervivientes con luz

Dosis de luz (J/cm2)

Figura 10

Figura 11

Figura 12 Figura 13

0.5 1 1.5 2 [Luzitina-F Met], µM

Figura 14 6 105

105

105

105

105

λ (nm)

Intensidad de fluorescencia (unidades arbitrarias)

Figura 15 1000

Intensidad de fluorescencia 800 600 400 200 0

λ (nm)

Figura 16 500

Tiempo (horas)

Intensidad de Fluorescencia Figura 17

Intensidad de Fluorescencia 20 15 10 5 0

λ (nm)

Figura 18

Volumen del tumor, mm2

[Luzitina-FMet]=10 mg/kg en ratones Balb/C con tumor CT26 implantado 1400 1200 1000 800

600 400 200 0

Días Figura 19

[Luzitina-C l Et]=10 mg/kg en ratón DBA/2 con tumor S91 implantado 2.5

Tamaño del tumor, cm

1.5 1

0.5 0

Días Figura 20

Figura 21 Figura 22