Preparación líquida de tejidos a partir de muestras biológicas, tejidos y células procesadas histopatológicamente.

Un método para preparar un lisado de biomoléculas, en el que el lisado de biomoléculas forma una biblioteca representativa de las proteínas de una muestra biológica fijada en formalina,

que comprende las etapas de:

(a) calentar una composición que comprende la muestra biológica fijada en formalina y un tampón de reacción a una temperatura entre alrededor de 80°C y alrededor de 100°C y durante un periodo de tiempo suficiente para afectar negativamente a la reticulación proteica en dicha muestra biológica, en el que tal periodo de tiempo es de alrededor de 10 minutos a alrededor de 4 horas, y

(b) tratar la composición resultante con una cantidad eficaz de una enzima proteolítica durante un periodo de tiempo suficiente para alterar la estructura tisular y celular de dicha muestra biológica, en el que tal periodo de tiempo es de alrededor de 30 minutos a alrededor de 24 horas,

en el que la enzima proteolítica es una endoproteasa.

Preparación líquida de tejidos a partir de muestras biológicas, tejidos y células procesadas histopatológicamente.

Campo de la invención La presente invención proporciona métodos para procesar muestras biológicas, tejidos y células procesadas histopatológicamente hasta un lisado de biomoléculas que forma una biblioteca representativa de proteínas. Los métodos permiten la extracción, el aislamiento, la solubilización, y el almacenamiento de biomoléculas de los lisados, lo que incluye proteínas y glicoproteínas. Este lisado de biomoléculas es soluble, diluible, puede ser fraccionado, y es utilizable en numerosos ensayos bioquímicos posteriores.

Antecedentes de la invención Durante más de cien años, las universidades e instituciones médicas públicas y académicas, clínicas de patología, instituciones biomédicas privadas, archivos de tejidos, hospitales y museos han conservado muestras biológicas con formalina y otros fijadores químicos tales como formaldehído y alcohol etílico. El fijador químico más habitual es formalina. La formalina se usa como fijador debido a su capacidad superior para conservar tanto la estructura tisular como la morfología celular. Esto ha dado como resultado el uso generalizado de formalina para la conservación eficaz de cortes histológicos para el análisis microscópico tradicional. La fijación en formalina es tan eficaz para conservar la estructura tisular y la morfología celular que el archivo con formalina es un auténtico tesoro que contiene millones de muestras. En este archivo hay muestras biológicas de tejido sano, muestras de tejido de prácticamente todas las enfermedades conocidas, y una multitud de formas de vida conservadas.

La forma más habitual de fijación de muestras se da por medio de la reticulación inducida por formalina de las proteínas de la muestra biológica. Estas reticulaciones de proteínas, aunque proporcionan una conservación excelente de la morfología celular, también hacen que la muestra fijada sea relativamente insoluble. Debido a estas reticulaciones de proteínas, los tipos de ensayos que se pueden llevar a cabo en una muestra fijada en formalina son escasos, incapaces de proporcionar resultados cuantitativos, y carecen de sensibilidad. De hecho, las muestras biológicas fijadas en formalina son prácticamente inútiles en muchas técnicas de ensayo modernas, que son muy cuantitativas y sensibles.

Es evidente, por lo tanto, que son muy deseables los métodos nuevos para solubilizar muestras biológicas fijadas en formalina u otras muestras biológicas fijadas químicamente.

Los documentos WO 02/46463 y EP-A-0 692 533 describen métodos para preparar un lisado de biomoléculas multiuso (usado por ejemplo para la purificación, extracción o análisis de ADN/ARN... etc.) , que comprenden las etapas de calentar una composición que comprende una muestra biológica (tejido) procesada histopatológicamente (p.ej. fijada con formalina o formaldehído, o incrustada en un medio de soporte, por ejemplo parafina) y una reacción en un tampón a una temperatura (p.ej. por encima del punto de fusión de la parafina) y un tiempo suficiente para fundir la parafina (por lo tanto, suficiente para afectar negativamente a la reticulación de las proteínas, ya que esta reticulación en dicha muestra se crea, por ejemplo, por la fijación en formalina) .

Ikeda K et al; 1 de marzo de 1998 () describe un método para preparar un lisado de biomoléculas para extraer las proteínas, que comprende las etapas de calentar una composición que comprende una muestra biológica fijada en formalina y un tampón de reacción a una temperatura (de alrededor de 100°C) y un tiempo suficiente para afectar negativamente a la reticulación de proteínas en dicha muestra biológica, en el que el tampón de reacción contiene un 2% de dodecil sulfato sódico (SDS) que permite alterar de manera eficaz la estructura tisular y celular de dicha muestra biológica.

Sumario de la invención Las realizaciones de la invención son:

1. La primera realización proporciona un método para preparar un lisado de biomoléculas, en el que el lisado de biomoléculas forma una biblioteca representativa de las proteínas de una muestra biológica fijada en formalina, que comprende las etapas de:

(a) calentar una composición que comprende la muestra biológica fijada en formalina y un tampón de reacción a una temperatura entre alrededor de 80°C y alrededor de 100°C y durante un periodo de tiempo suficiente para afectar negativamente a la reticulación proteica en dicha muestra biológica, en el que tal periodo de tiempo es de alrededor de 10 minutos a alrededor de 4 horas, y

(b) tratar la composición resultante con una cantidad eficaz de una enzima proteolítica durante un periodo de tiempo suficiente para alterar la estructura tisular y celular de dicha muestra biológica, en el que tal periodo de tiempo es de alrededor de 30 minutos a alrededor de 24 horas, en el que la enzima proteolítica es una endoproteasa.

2. La segunda realización de la invención proporciona el método según la realización 1, en el que dicha muestra

biológica comprende una población sustancialmente homogénea de tejidos o células.

3. El método según la realización 1, que comprende además, antes de la etapa (a) , la etapa de eliminar toda la parafina presente en dicha muestra biológica mediante uno o más métodos seleccionados del grupo que consiste en: añadir un disolvente orgánico; calentar; calentar y añadir un tampón que comprende Tris; y calentar y añadir un disolvente orgánico.

4. El método según la realización 1, que comprende además la etapa de alterar mecánicamente dicha muestra biológica mediante al menos una técnica seleccionada del grupo que consiste en:

homogeneización manual; agitación en vórtex; y mezcla física.

5. El método según la realización 1, en el que dicho tratamiento con enzima proteolítica se lleva a cabo a una temperatura entre alrededor de 37°C y alrededor de 65°C.

6. El método según la realización 1, en el que dicho tampón de reacción comprende un detergente.

7. El método según la realización 1, en el que la etapa (b) se lleva a cabo en presencia de un detergente.

8. El método según la realización 6, en el que dicho detergente se selecciona del grupo que consiste en Nonidet P40, SDS, Tween-20, Triton X, y desoxicolato sódico.

9. El método según la realización 7, en el que dicho detergente se selecciona del grupo que consiste en Nonidet P40, SDS, Tween-20, Triton X, y desoxicolato sódico.

10. El método según la realización 1, en el que dicha enzima proteolítica se selecciona del grupo que consiste en quimotripsina, tripsina y endoproteinasa Lys-C.

11. El método según la realización 1, en el que dicho tampón de reacción comprende Tris y tiene un pH en el intervalo de alrededor de 6, 0 a alrededor de 9, 0.

12. El método según la realización 1, que comprende además la etapa de fraccionar dicho lisado hasta fracciones de biomoléculas diferentes y separadas y obtener una fracción de proteínas y una fracción de ácidos nucleicos.

13. El método según la realización 12, en el que cada fracción de biomoléculas contiene biomoléculas diferentes y separadas adecuadas para el uso en ensayos bioquímicos.

14. El método según la realización 1, en el que dicha muestra biológica se selecciona de un grupo que consiste en tejidos/células fijados en formalina, tejidos/células fijados en formalina/incrustados en parafina (FFPE) , bloques de tejidos FFPE y células de esos bloques, y células de cultivos de tejidos que se han fijado en formalina y/o incrustado en parafina.

15. El uso de un equipo en un método para preparar un lisado biológico según cualquiera de las realizaciones 1 a 14, que comprende al menos:

(a) una muestra biológica fijada en formalina

(b) una enzima proteolítica, y

(c) un detergente,

en el que la enzima proteolítica es una endoproteasa.

16. Un método para detectar uno o más analitos en un lisado de biomoléculas que se sospecha que contiene dicho analito o más analitos, en el que el lisado es una biblioteca representativa de todas las proteínas de una muestra biológica fijada en formalina obtenida mediante un método según cualquiera de las realizaciones 1 a 14, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la fracción de proteínas obtenida mediante el método según la realización 12 con una matriz, en la que dicha matriz comprende uno o más agentes de captura de especificidad de unión conocida inmovilizados sobre una superficie de soporte de una manera posicionalmente distinguible;... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar un lisado de biomoléculas, en el que el lisado de biomoléculas forma una biblioteca representativa de las proteínas de una muestra biológica fijada en formalina, que comprende las etapas de:

(a) calentar una composición que comprende la muestra biológica fijada en formalina y un tampón de reacción a una temperatura entre alrededor de 80°C y alrededor de 100°C y durante un periodo de tiempo suficiente para afectar negativamente a la reticulación proteica en dicha muestra biológica, en el que tal periodo de tiempo es de alrededor de 10 minutos a alrededor de 4 horas, y

(b) tratar la composición resultante con una cantidad eficaz de una enzima proteolítica durante un periodo de tiempo suficiente para alterar la estructura tisular y celular de dicha muestra biológica, en el que tal periodo de tiempo es de alrededor de 30 minutos a alrededor de 24 horas,

en el que la enzima proteolítica es una endoproteasa.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra biológica comprende una población sustancialmente homogénea de tejidos o células.

3. El método según la reivindicación 1, que comprende además, antes de la etapa (a) , la etapa de eliminar toda la parafina presente en dicha muestra biológica mediante uno o más métodos seleccionados del grupo que consiste en añadir un disolvente orgánico; calentar; calentar y añadir un tampón que comprende Tris; y calentar y añadir un disolvente orgánico.

4. El método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de alterar mecánicamente dicha muestra biológica mediante al menos una técnica seleccionada del grupo que consiste en: homogeneización manual; agitación en vórtex; y mezcla física.

5. El método según la reivindicación 1, en el que dicho tratamiento con enzima proteolítica se lleva a cabo a una temperatura entre alrededor de 37°C y alrededor de 65°C.

6. El método según la reivindicación 1, en el que dicho tampón de reacción comprende un detergente.

7. El método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) se lleva a cabo en presencia de un detergente.

8. El método según la reivindicación 6, en el que dicho detergente se selecciona del grupo que consiste en Nonidet P40, SDS, Tween-20, Triton X, y desoxicolato sódico.

9. El método según la reivindicación 7, en el que dicho detergente se selecciona del grupo que consiste en Nonidet P40, SDS, Tween-20, Triton X, y desoxicolato sódico.

10. El método según la reivindicación 1, en el que dicha enzima proteolítica se selecciona del grupo que consiste en quimotripsina, tripsina y endoproteinasa Lys-C.

11. El método según la reivindicación 1, en el que dicho tampón de reacción comprende Tris y tiene un pH en el intervalo de alrededor de 6, 0 a alrededor de 9, 0.

12. El método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de fraccionar dicho lisado hasta fracciones de biomoléculas diferentes y separadas y obtener una fracción de proteínas y una fracción de ácidos nucleicos.

13. El método según la reivindicación 12, en el que cada fracción de biomoléculas contiene biomoléculas diferentes y separadas adecuadas para el uso en ensayos bioquímicos.

14. El método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra biológica se selecciona de un grupo que consiste en tejidos/células fijados en formalina, tejidos/células fijados en formalina/incrustados en parafina (FFPE) , bloques de tejidos FFPE y células de esos bloques, y células de cultivos de tejidos que se han fijado en formalina y/o incrustado en parafina.

15. El uso de un equipo en un método para preparar un lisado biológico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende al menos:

(a) una muestra biológica fijada en formalina

(b) una enzima proteolítica, y

(c) un detergente,

en el que la enzima proteolítica es una endoproteasa.

16. Un método para detectar uno o más analitos en un lisado de biomoléculas que se sospecha que contiene dicho analito o más analitos, en el que el lisado es una biblioteca representativa de todas las proteínas de una muestra biológica fijada en formalina obtenida mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la fracción de proteínas obtenida mediante el método según la reivindicación 12 con una matriz, en la que dicha matriz comprende uno o más agentes de captura de especificidad de unión conocida inmovilizados sobre una superficie de soporte de una manera posicionalmente distinguible; y

(b) detectar la unión o ausencia de unión de uno o más analitos en dicha fracción de proteínas obtenida a dichos reactivos de captura inmovilizados.

17. El método según la reivindicación 16, en el que dicho reactivo de captura se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de un dominio, regiones estructurales modificadas, péptidos, aptámeros de ácidos nucleicos, un resto receptor, reactivos de afinidad, moléculas pequeñas, y ligandos de proteínas.

18. El método según la reivindicación 16, en el que la superficie de soporte comprende un material seleccionado del grupo que consiste en vidrio, vidrio derivatizado, silicio, silicio derivatizado, silicio poroso, plástico, membranas de nitrocelulosa, membranas de nailon, y membranas de PVDF.

19. Un método para analizar una diversidad de lisados de biomoléculas obtenidos a partir de una diversidad de muestras biológicas fijadas en formalina mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que los lisados son bibliotecas representativas de las proteínas de dicha muestra biológica fijada en formalina que comprende las etapas de

(a) inmovilizar una diversidad de las fracciones de proteínas obtenidas a partir de una muestra biológica fijada en formalina mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 sobre una superficie de soporte, en el que cada lisado se inmoviliza en una posición discreta sobre dicha superficie;

(b) poner en contacto dicha superficie de soporte con un reactivo de afinidad de unión conocida;

(c) detectar la presencia o ausencia de unión de dicho reactivo de afinidad de unión conocida en dichas posiciones específicas sobre dicha superficie de soporte.

20. El método según la reivindicación 19, en el que el lisado de biomoléculas se deposita sobre la superficie de soporte mediante un método seleccionado del grupo que consiste en depósito manual, inyección de tinta, impresión robótica por contacto, impresión robótica sin contacto y depósito piezoeléctrico.

21. El método según la reivindicación 19, en el que dicho reactivo de afinidad de unión conocida se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de un dominio, regiones estructurales modificadas, péptidos, aptámeros de ácidos nucleicos, un resto receptor, reactivos de afinidad, moléculas pequeñas, y ligandos de proteínas.

22. El método según la reivindicación 19, en el que dicha superficie de soporte comprende un material seleccionado del grupo que consiste en vidrio, vidrio derivatizado, silicio, silicio derivatizado, silicio poroso, plástico, membranas de nitrocelulosa, membranas de nailon, y membranas de PVDF.

23. El método según la reivindicación 16, en el que dicho lisado de biomoléculas se somete a una etapa de fraccionamiento antes de poner en contacto dicho lisado con dicha matriz.

24. El método según la reivindicación 16, en el que la etapa de detección (b) se lleva a cabo mediante el uso de un reactivo de detección que se une de manera específica a uno o más de los analitos que se sospecha que están presentes en dicha muestra.

25. El método según la reivindicación 24, en el que dichos reactivos de detección son proteínas.

26. El método según la reivindicación 19, en el que uno o más de dichos lisados de biomoléculas se someten a una etapa de fraccionamiento antes de inmovilizar una o más de las fracciones resultantes sobre dicha superficie.

27. El método según la reivindicación 26, en el que dicha fracción es una fracción que contiene proteínas.

28. El uso de un lisado de biomoléculas preparado mediante un método de cualquiera de las reivindicaciones 1214 en una técnica de diagnóstico.

29. El uso según la reivindicación 28, en el que dicha técnica se selecciona del grupo que consiste en cromatografía, matrices de proteínas, transferencia de Western, inmunoprecipitación, columnas de afinidad, ensayos de corte y empalme alternativo, análisis de mutaciones, amplificación de ácidos nucleicos, sondas marcadas para análisis de micromatrices, análisis de RFLP, transferencia de Southern, electroforesis en gel de poliacrilamida

unidimensional, electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional, análisis en serie de la expresión génica, HPLC, FPLC, espectroscopía de masas MALDI-TOF, espectroscopía de masas SELDI, cromatografía líquida, espectrometría de masas, ensayos ELISA, RT-PCR cuantitativa, detección de polimorfismos de nucleótidos simples, genotipado y secuenciación.

Figura 1

Preparación Líquida de Tejidos

Tejido FFPE Bloque de Tejido Células Fij. en Formalina Células FFPE

Licuar

Fraccionar

Proteína Tisular Líquida ADN Tisular Líquido ARN Tisular Líquido Obtener la Fracción Obtener la Fracción Obtener la Fracción Que Contiene Proteína Que Contiene ADN Que Contiene ARN

Figura 2

Figura 3

Carril 1. ADN de control genómico total Carril 2. Fracción 1: contiene ADN Carril 3. Fracción 2: contiene proteína en una preparación Liquid TissueTM habitual