Preparación de plantillas para la secuenciación de ácidos nucleicos.

Un procedimiento para generar una plantilla para una reacción de secuenciación de ácidos nucleicos quecomprende,

(i) proporcionar al menos una molécula de ácido nucleico bicatenario unida a un soporte sólido por el extremo5', en la que la molécula de ácido nucleico bicatenario comprende una región diana a ser secuenciada ysecuencias no diana que flanquean a la región diana,

(ii) escindir una hebra de la molécula de ácido nucleico bicatenario, en un sitio abásico, en el que el sitio parala escisión está ubicado en la secuencia no objetivo, y

(iii) someter la hebra escindida a unas condiciones desnaturalizantes para eliminar la porción de la hebraescindida que no está unida al soporte sólido, generando así un molde monocatenario para una reacción desecuenciación de ácidos nucleicos.

Preparación de plantillas para la secuenciación de ácidos nucleicos

Campo de la invención [0001] La invención se refiere a la preparación de moldes para reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos y a procedimientos de secuenciación de dichos moldes. En particular, la invención se refiere a la preparación de moléculas de molde de ácidos nucleicos listas para la secuenciación mediante la escisión de una o de ambas hebras de un ácido nucleico bicatenario inmovilizado sobre un soporte sólido.

Antecedentes de la invención [0002] Los procedimientos de secuenciación de ácidos nucleicos se han conocido en la materia durante muchos años. Uno de los procedimientos mejor conocidos es el método "didesoxi" de Sanger, que se basa en el uso de trifosfatos de didesoxirribonucleósidos como terminadores de la cadena. El método de Sanger se ha adoptado para su uso en la secuenciación automática con el uso de terminadores de la cadena que incorporan marcadores fluorescentes.

En la materia también se conocen procedimientos de secuenciación de ácidos nucleicos que se basan en ciclos sucesivos de incorporación de análogos de ácidos nucleicos marcados con fluorescencia. En dichos procedimientos de "secuenciación mediante síntesis" o "secuenciación en ciclo" la identidad de la base añadida se determina después de la adición de cada nucleótido detectando el marcador fluorescente.

En particular, el documento US 5.302.509 describe un procedimiento para la secuenciación de un molde de polinucleótido que implica la realización de múltiples reacciones de extensión usando una polimerasa de ADN o una ligasa de ADN para incorporar sucesivamente polinucleótidos marcados complementarios de una hebra. En dicha reacción de "secuenciación mediante síntesis" se crea una nueva hebra de polinucleótidos apareada con la hebra de molde en la dirección 5’ a 3’ mediante la incorporación sucesiva de nucleótidos individuales complementarios de la hebra de molde. Los trifosfatos de nucleósidos usados en la reacción de secuenciación están marcados en la posición 3’ con diferentes marcajes de 3’, lo que permite la determinación de la identidad del nucleótido incorporado según se añaden nucleótidos sucesivos.

Con objeto de maximizar el rendimiento de las reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos, es ventajoso ser capaz de secuenciar múltiples moléculas de molde en paralelo. El procesamiento en paralelo de múltiples moldes puede conseguirse con el uso de la tecnología de matrices de ácidos nucleicos. Estas matrices consisten típicamente en una matriz de alta densidad de polinucleótidos inmovilizados sobre un material de soporte sólido.

En la materia se han descrito varios procedimientos para la fabricación de matrices de ácidos nucleicos inmovilizados. De particular interés, ambos documentos WO 98/44151 y WO 00/18957 describen procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos que permiten que los productos de la amplificación sean inmovilizados sobre un soporte sólido con objeto de formar matrices formadas por agregados o "colonias" formadas por una pluralidad de hebras idénticas de polinucleótidos inmovilizados y una pluralidad de hebras complementarias idénticas 45 inmovilizadas. Las matrices de este tipo se denominan en este documento "matrices agregadas". Las moléculas de ácidos nucleicos presentes en las colonias de ADN de las matrices agregadas preparadas según estos procedimientos pueden proporcionar moldes para las reacciones de secuenciación, por ejemplo, según se describe en el documento WO 98/44152.

Los productos de las reacciones de amplificación en fase sólida, tales como los descritos en los documentos WO 98/44151 y WO 00/18957, son las denominadas estructuras "en puente", formadas por el apareamiento de pares de hebras de polinucleótidos inmovilizadas y hebras complementarias inmovilizadas, estando ambas hebras unidas al soporte sólido por el extremo 5’. Las matrices formadas por dichas estructuras en puente proporcionan moldes ineficaces para la secuenciación de ácidos nucleicos, dado que la hibridación de un 55 cebador de secuenciación convencional a una de las hebras inmovilizadas no se ve favorecida en comparación con el apareamiento de esta hebra con su hebra complementaria inmovilizada en unas condiciones de hibridación estándar.

Con objeto de proporcionar moldes más adecuados para la secuenciación de ácidos nucleicos, se prefiere 60 eliminar sustancialmente todas o al menos una porción de una de las hebras inmovilizadas en la estructura "en puente", con objeto de generar un molde de sea al menos parcialmente monocatenario. La porción del molde que sea monocatenaria estará así disponible para la hibridación con un cebador de secuenciación. El proceso de eliminar todas o una porción de una de las hebras inmovilizadas en una estructura de ácidos nucleicos bicatenarios "en puente" puede denominarse en este documento "linealización".

En la materia se sabe que las estructuras de molde en puente pueden linealizarse mediante la escisión de una o de ambas hebras con una endonucleasa de restricción. Un inconveniente del uso de las enzimas de restricción para la linealización es que requieren la presencia de una secuencia de reconocimiento específica para la enzima en una ubicación adecuada en la estructura de molde en puente. Existe el riesgo de que la misma secuencia de reconocimiento pueda aparecer en otro sitio de la estructura en puente, lo que significa que la enzima podría cortar en uno o más sitios adicionales, además del sitio de escisión pretendido para la linealización. Esto puede suponer un problema, en particular cuando las estructuras en puente que se van a linealizar son derivadas mediante la amplificación en fase sólida de moldes de una secuencia parcialmente desconocida, dado que no puede predecirse con antelación si una enzima en particular cortará dentro de la región de la secuencia desconocida.

Por lo tanto, en un aspecto general, la invención proporciona procedimientos para la linealización de moldes que no requieren la escisión con endonucleasas de restricción, o con endonucleasas de corte.

El documento WO/0053617 desvela un procedimiento para ensamblar secuencias largas de ADN a partir de oligonucleótidos sintéticos cortos. Los oligonucleótidos cortos se sintetizan in situ sobre un soporte sólido, y subsiguientemente se escinden del soporte sólido antes o durante el ensamblaje en secuencias completas de ADN. Una fracción escindible puede unirse al soporte sólido y a los oligonucleótidos. Esta fracción escindible puede contener un sitio abásico, que puede ser escindido entonces por la Endonucleasa IV.

En otro aspecto general, la invención se refiere a procedimientos para la linealización de moldes que sean compatibles con un tipo en particular de micromatriz con soporte sólido. Más específicamente, la invención proporciona procedimientos de linealización que son compatibles con matrices formadas sobre hidrogeles de poliacrilamida sobre soporte sólido.

En la preparación de matrices moleculares basadas en hidrogel sobre soporte sólido, se forma un hidrogel y las moléculas son desplegadas desde el mismo. Estas dos características - formación del hidrogel y construcción de la matriz -pueden efectuarse secuencialmente o simultáneamente. Cuando el hidrogel se forma antes de la formación de la matriz, se produce típicamente dejando polimerizar una mezcla de comonómeros. Generalmente, la mezcla de comonómeros contiene acrilamida y uno o más comonómeros, el último de los cuales permite, en parte, la subsiguiente inmovilización de las moléculas de interés para que formen la matriz molecular.

Los comonómeros usados para crear el hidrogel contienen típicamente una funcionalidad que sirve para participar en la reticulación del hidrogel y/o para inmovilizar el hidrogel sobre el soporte sólido y facilitar la asociación con las moléculas objetivo de interés.

Los presentes inventores han demostrado que las matrices agregadas pueden formarse sobre dichos hidrogeles sobre soporte sólido mediante la amplificación de ácidos nucleicos en fase sólida usando cebadores de amplificación directa e inversa unidos al hidrogel por sus extremos 5, conduciendo a la producción de matrices agregadas de productos de amplificación con una estructura "en puente". Con objeto de maximizar la eficacia de las reacciones de secuenciación que usan moldes derivados de dichos productos en puente, hay una necesidad de procedimientos de linealización que sean compatibles con la superficie del hidrogel y con las subsiguientes reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos.

Resumen de la invención 45 [0016] La invención... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para generar una plantilla para una reacción de secuenciación de ácidos nucleicos que comprende, 5

(i) proporcionar al menos una molécula de ácido nucleico bicatenario unida a un soporte sólido por el extremo 5’, en la que la molécula de ácido nucleico bicatenario comprende una región diana a ser secuenciada y secuencias no diana que flanquean a la región diana,

(ii) escindir una hebra de la molécula de ácido nucleico bicatenario, en un sitio abásico, en el que el sitio para 10 la escisión está ubicado en la secuencia no objetivo, y

(iii) someter la hebra escindida a unas condiciones desnaturalizantes para eliminar la porción de la hebra escindida que no está unida al soporte sólido, generando así un molde monocatenario para una reacción de secuenciación de ácidos nucleicos.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa (ii) se lleva a cabo mediante el tratamiento con una endonucleasa, calor o un álcali.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que una hebra de la molécula de ácido nucleico bicatenario incluye una base de uracilo y el sitio abásico se genera mediante el tratamiento con uracilo glucosilasa; o en el que la molécula de ácido nucleico bicatenario incluye una 8-oxo-guanina y el sitio abásico se genera mediante el tratamiento con FPG glucosilasa; o en el que la molécula de ácido nucleico bicatenario incluye una desoxiinosina y el sitio abásico se genera mediante el tratamiento con AlkA glucosilasa.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico bicatenario comprende un uracilo,

una 8-oxo-guanina o una desoxiinosina y el sitio abásico se forma en el sitio del uracilo, la 8-oxo-guanina o la desoxiinosina.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el sitio abásico es generado por una glucosilasa y el sitio abásico es escindido por una endonucleasa. 30

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la escisión se lleva a cabo mediante la exposición a una mezcla de la glucosilasa y la endonucleasa.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la molécula de ácido nucleico bicatenario 35 forma parte de una matriz agregada de moléculas de ácidos nucleicos.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la matriz agregada se prepara mediante amplificación de ácidos nucleicos en fase sólida usando cebadores de amplificación directos e inversos unidos al soporte sólido por el extremo 5’ y hay presente una 8-oxo-guanina, una desoxiinosina o un uracilo en los cebadores de amplificación ya sean directos o inversos.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la 8-oxo-guanina, la desoxiinosina o el uracilo está presente como la base terminal 3’ en los cebadores de amplificación ya sean directos o inversos.

10. Un procedimiento de secuenciación de ácidos nucleicos que comprende formar una plantilla para la secuenciación de ácidos nucleicos usando el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, y realizar una reacción de secuenciación de ácidos nucleicos para determinar la secuencia de al menos una región de la plantilla.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la reacción de secuenciación de ácidos nucleicos comprende hibridar un cebador de secuenciación con una región monocatenaria de la plantilla generada en la etapa (iii) , incorporar secuencialmente uno o más nucleótidos en una hebra de polinucleótidos complementaria de la región de la plantilla a ser secuenciada, identificar la base presente en uno o más del (los) nucleótido (s) incorporado (s) y determinar así la secuencia de una región de la plantilla.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el soporte sólido está recubierto con silanos funcionalizados.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el soporte sólido es un hidrogel de 60 poliacrilamida sobre soporte sólido.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el hidrogel sobre soporte sólido se prepara mediante un procedimiento que comprende polimerizar sobre un soporte sólido una mezcla de:

(i) un primer comonómero que es acrilamida, metacrilamida, metacrilato de hidroxietilo o N-vinil pirrolidinona; y

(ii) un segundo comonómero que es una acrilamida funcionalizada o un acrilato de fórmula (I) :

H2C=C (H) -C (=O) -A-B-C (I) ;

o un metacrilato o una metacrilamida de fórmula (II) :

H2C=C (CH3) -C (=O) -A-B-C- (II) 10 en las que:

A es NR u O, en la que R es hidrógeno o un grupo hidrocarbilo saturado opcionalmente sustituido que comprende entre 1 y 5 átomos de carbono;

-B- es un birradical alquileno opcionalmente sustituido de fórmula - (CH2) n- en la que n es un número entero entre 1 y 50; y en la que n = 2 o más, uno o más birradicales etileno opcionalmente sustituidos -CH2CH2- de dicho birradical alquileno pueden sustituirse independientemente por porciones de etinileno y etinileno; y en la que n = 1 o más, uno o más birradicales metileno -CH2- pueden sustituirse independientemente por un birradical hidrocarbonado mono o policíclico opcionalmente sustituido que comprende de 4 a 50 átomos de carbono, o un correspondiente birradical heteromonocíclico o heteropolicíclico en el que al menos 1 CH2 ó CH2 está sustituido por un átomo de oxígeno, de azufre o de nitrógeno, o un grupo NH; y C es un grupo para la reacción con un compuesto, para unir covalentemente dicho compuesto a dicho hidrogel para formar un producto polimerizado,

caracterizada porque la polimerización se realiza en, e inmoviliza el producto polimerizado a, un soporte sólido que no está modificado covalentemente en su superficie.

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el soporte sólido es plano. 30

Número

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

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