Polipéptidos inhibidores competitivos de proteína GQ, procedimientos de preparación y usos de los mismos.

Polipéptido tal como se muestra en la SEC ID Nº 2.

Polipéptidos inhibidores competitivos de proteína GQ, procedimientos de preparación y usos de los mismos Sector de la invención La presente invención se refiere a un polipéptido. Más particularmente, la presente invención se refiere a un péptido inhibidor competitivo contra la subunidad a de la proteína Gq. La presente invención también se refiere a un procedimiento para preparar el polipéptido, a una formulación que comprende el polipéptido y a la utilización del polipéptido en la fabricación de un fármaco para revertir la remodelación miocárdica.

Antecedentes de la invención La remodelación miocárdica (es decir, conocida habitualmente como hipertrofia miocárdica) se refiere al síntoma en el que los cardiocitos se encuentran en cantidad constante pero aumentan de volumen. Es una respuesta orquestada de los cardiocitos a diversos estímulos patológicos y puede ser el resultado de estimulación con inducciones hemorreológicas tales como hipertensión, valvulopatía, infarto agudo de miocardio, cardiopatía congénita y aumento inducido por el ejercicio de la carga de presión así como sustancias endocrinas humorales tales como endotelina, angiotensina II, catecolaminas, factor de crecimiento transformante β, interleuquina-1, que tienen de este modo una tasa de morbilidad extremadamente alta[1]. Solamente para la hipertensión en solitario, la tasa de morbilidad es del 15-20% en Occidente. Aunque la tasa es ligeramente inferior en China, el número de pacientes supera los 150 millones. La hipertrofia miocárdica puede ofrecer cierta compensación en la fase inicial del síntoma. A medida que la afección avanza, la hipertrofia miocárdica puede conducir a una función cardiaca alterada a través de anomalías tales como reorganización deficiente de las fibras miocárdicas y disfunción contráctil cardiaca y similares, y ésta puede desarrollarse adicionalmente a insuficiencia cardiaca. La hipertrofia miocárdica es un contribuyente principal a la mortalidad, dado que promueve la insuficiencia cardiaca que, a su vez, causa la muerte. Por lo tanto, la exploración de un fármaco específico eficaz en el tratamiento y el control de la hipertrofia miocárdica es no solamente el asunto y un punto caliente de la investigación al que se enfrentan los científicos, sino también una preocupación de salud pública fundamental que requiere una solución inmediata en todo el globo.

Hasta la fecha, no ha habido ningún fármaco terapéutico en clínica específico para tratar hipertrofia miocárdica, principalmente debido a sus múltiples causas etiológicas y complejo mecanismo subyacente. Estudios de investigación han demostrado que la estimulación de estiramiento causada por cambios hemorreológicos o la estimulación por una sustancia endocrina humoral (que son causalidad recíproca en la enfermedad) pueden inducir respuestas patológicas, tales como hipertrofia miocárdica, fibrosis intersticial, etc., casi todas a través de los eventos de transducción de señales de receptor y post-receptor[2]. En base a dicho descubrimiento, se intentaron terapias dirigidas a las causas etiológicas para hipertrofia miocárdica utilizando un antagonista de endotelina, un fármaco hipotensor, un inhibidor de angiotensina convertasa, etc., que demostraron ser algo eficaces. Sin embargo, dado que muchos factores y receptores están implicados en la respuesta patológica, y adicionalmente, los antagonistas/inhibidores descritos anteriormente pueden inducir regulación positiva de sus correspondientes receptores y el aumento de la secreción compensatoria de ligandos para otros receptores relacionados mientras suprimen la función de una molécula señal, los efectos del tratamiento resultan ser muy limitados[3-6]. Por lo tanto, existe una gran necesidad de desarrollar un fármaco específico útil en la profilaxis y el tratamiento a través de rutas más fundamentales.

Las proteínas G son proteínas de unión a GTP heterotriméricas constituidas por las subunidades α, β, y γ y desempeñan un papel clave en la transducción de señales estimuladoras desde el espacio extracelular al interior del espacio intracelular. La norepinefina (NE) , endotelina (ET) , angiotensina II (Ang II) , y similares agonizan un α1-AR, un receptor AT1, y un receptor de endotelina, respectivamente, a continuación activan la enzima efectora, fosfolipasa C (PLC-β) , a través de las proteínas G de la familia Gq, enzima que, a su vez, actúa sobre PIP2 para producir DAG e IP3; e inducir expresión génica embrionaria dentro de una célula habitualmente mediante la ruta de señalización de DAG-PKC-Ras-MAPK e IP3-Ca2+-CaN/CaMPKII-NFAT3 / GATA-4, dando como resultado remodelación miocárdica. Además de activar Raf1 a través de integrinas, los estímulos de estiramiento pueden estimular la secreción de Ang II, NE y ET1, y por lo tanto también está estrechamente relacionada con Gq. Además, se ha observado en experimentos que: (1) durante el proceso patológico de remodelación miocárdica, la señal de Gq es significativamente excesiva, cuyo nivel es significativamente mayor que la señal de Gq fisiológica en tejidos normales; tanto la función como la morfología del cardiocito no se alteran significativamente cuando la expresión de Gqa aumenta dos veces (o menos) , la hipertrofia miocárdica y la disfunción contráctil en el corazón se producen cuando la expresión de Gqa aumentaba cuatro veces, la insuficiencia cardiaca ocurre cuando la expresión de Gqa aumentaba ocho veces; (2) la sobre-expresión del gen de Gqa de manera transgénica en el corazón de un ratón puede inducir la evidente hipertrofia miocárdica y la insuficiencia cardiaca mortal en el animal; (3) la inactivación de la expresión de Gqa en el corazón puede atenuar significativamente la respuesta hipertrófica del corazón a la carga de presión[7-9]. Por lo tanto, puede verse que el Gqa desempeña un papel central en la aparición y el desarrollo de remodelación miocárdica, y se considera una diana común para múltiples rutas de señalización y un elemento de señalización clave para mediar en la remodelación/hipertrofia miocárdica causada por diversos factores. Por lo tanto, se espera que la regulación sobre Gqa sea una nueva estrategia y quizás una exitosa manera de revertir la remodelación/hipertrofia miocárdica.

Sin embargo, los animales transgénicos son una clase de animales en los que el gen exógeno se introduce por

medios experimentales, se integra de forma estable dentro del genoma cromosómico y es capaz de ser heredado por su descendencia; el principio para criar animales transgénicos es el siguiente: un gen/fragmento de interés abordado con procesos en biología molecular se inyecta en cigotos/células embrionarias de preimplantación de animales experimentales mediante diversos procedimientos genéticos, el cigoto/célula embrionaria de preimplantación inyectada se transplanta además al oviducto o el útero del animal receptor y se le permite desarrollarse a un animal transgénico que porta el gen exógeno, y la función del gen exógeno se anota analizando el estado de integración del gen exógeno en el animal transgénico y el fenotipo del animal transgénico, y aquellos animales manipulados genéticamente con excelente calidad se crían mediante un método de mejora genética típico. Por lo tanto, en base a la tecnología actual, el tratamiento de remodelación/hipertrofia miocárdica que aparece en adultos en el ser humano con técnicas transgénicas es poco práctico o no es racional. Adicionalmente, la inactivación de la expresión de Gqa en el corazón dará como resultado efectos secundarios gravemente tóxicos dado que Gqa tiene también importantes funciones fisiológicas. Por lo tanto, las dos estrategias y métodos descritos anteriormente no tienen ningún valor práctico aplicable en el tratamiento clínico de remodelación/hipertrofia miocárdica.

Por esta razón, los inventores se han preparado una serie de polipéptidos con actividades significativas para revertir remodelación/hipertrofia miocárdica utilizando técnicas sistemáticas, tales como, diseño molecular, optimización, ingeniería genética, preparación de polipéptidos, cribado para actividades in vitro e in vivo, etc.

El documento WO 99/05294 se refiere a agentes proteináceos y no proteináceos que inhiben la señalización del

receptor acoplado a Gq cardiaca y a un método de inhibidor de hipertrofia ventricular inadaptada asociada con diversas formas de cardiopatía en transición a insuficiencia cardiaca. En particular, el documento WO 99/05294 da a conocer la expresión miocárdica dirigida de los 55 aminoácidos carboxi-terminales de la subunidad a de Gq para el tratamiento o la prevención de hipertrofia miocárdica en ratones transgénicos... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido tal como se muestra en la SEC ID Nº 2.

2. Polipéptido tal como se muestra en la SEC ID Nº 3.

3. Polipéptido tal como se muestra en la SEC ID Nº 5.

4. Polipéptido tal como se muestra en la SEC ID Nº 6. 10

5. Polipéptido tal como se muestra en la SEC ID Nº 7.

6. Polipéptido tal como se muestra en la SEC ID Nº 8.

7. Formulación, que comprende los polipéptidos, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y aditivos farmacéuticamente aceptables.

8. Formulación, según la reivindicación 7, en la que la formulación es una inyección parenteral.

9. Utilización del polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la fabricación de un fármaco, junto con aditivos farmacéuticamente aceptables, para tratar hipertrofia miocárdica.

10. Procedimiento de preparación del polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende la etapa de:

realizar síntesis polipeptídica según la secuencia de aminoácidos, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en un sintetizador de polipéptidos.

11. Procedimiento de preparación del polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende la 30 etapa de:

ligar la secuencia de nucleótidos correspondiente en un vector para formar un vector recombinante;

transformar dicho vector recombinante en una célula huésped; 35

inducir a dicha célula huésped a expresar dicho polipéptido;

separar dicho polipéptido.

12. Procedimiento, según la reivindicación 11, en el que dicho vector es el plásmido pIVEX2.3MCS, y dicha célula huésped es la cepa BL21 de Escherichia coli.