Polipéptidos de Lutzomyia longipalpis y métodos de uso.

Un polipéptido salival de Lu. longipalpis sustancialmente purificado,

donde el polipéptido comprende

a) una secuencia de aminoácido al menos un 80% idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácidopresentada como SEC. ID. Nº: 15;

b) un fragmento inmunogénico, que comprende al menos ocho aminoácidos consecutivos de la secuencia deaminoácido presentada como SEC. ID. Nº: 15, específicamente reconocido por un anticuerpo que se une deforma específica con la secuencia de aminoácido que se presenta como SEC. ID. Nº: 15; o

c) la secuencia de aminoácido que se presenta como SEC. ID. Nº: 15; y donde la administración del polipéptidoa un sujeto provoca una respuesta inmune a Lu. longipalpis.

Polipéptidos de Lutzomyia longipalpis y métodos de uso Campo de la invención La divulgación se refiere a proteínas sustancialmente purificadas de las glándulas salivales del flebótomo Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis) , o vectores recombinantes que expresan estas proteínas, así como a una respuesta inmune que producen estas proteínas. Esta divulgación se refiere también a la producción de una respuesta inmune que afecta a la supervivencia de la Leishmania.

Antecedentes La leishmaniasis es un conjunto de enfermedades causadas por protozoos del género Leishmania y que afecta a muchos millones de personas en todo el mundo. En el ser humano, la infección por el parásito se manifiesta en forma de una enfermedad cutánea, causada principalmente por L. major, L. tropica, y L. mexicana; de una enfermedad mucocutánea causada principalmente por L. brasiliensis; o de una enfermedad visceral causada principalmente por L. donovani y L. chagasi. En cánidos, las infecciones por Leishmania se manifiestan como una enfermedad visceral que puede provocar unos elevados índices de mortalidad.

Todas las enfermedades por Leishmania se transmiten a sus huéspedes vertebrados a través de flebótomos, que adquieren el patógeno al alimentarse de huéspedes infectados y lo transmiten regurgitando el parásito en el lugar en el que se alimentan de sangre posteriormente (Killick-Kendrick, Biology of Leishmania in phlebotomine sand flies. En Biology of the Kinetoplastida. W. Lumsden y D. Evans, compiladores. Academic Press, New York. 395, 1979) .

Mientras se alimenta de sangre, el flebótomo saliva en la piel del huésped. La saliva contiene compuestos anticoagulantes, antiplaquetarios y vasodilatadores que incrementan el foco hemorrágico en el que se alimentan los flebótomos (Ribeiro et al., Comp. Biochem. Physiol 4:683, 1986; Charlab et al., Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 26:15155, 1999) . Algunos de estos componentes son también inmunomoduladores. Por ejemplo, el flebótomo del Nuevo Mundo Lutzomyia longipalpis contiene el péptido 6.5kDa, maxadilano, que es el vasodilatador más potente conocido (Lerner et al., J. Biol. Chem. 17:11234, 1991) . Por otra parte, el propio maxadilano tiene actividades inmunosupresoras (Qureshi et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 6:665, 1996) , al igual que muchos vasodilatadores persistentes, tales como la prostaglandina E2 (Makoul et al., J. Immunol. 134:2645, 1985; Santoli y Zurier, J. Immunol 143:1303, 1989; Stockman y Mumford, Exp. Hematol 2:65, 1974) y el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (Nong et al., J. Immunol. 1 :45, 1989) . Los flebótomos del Viejo Mundo no tienen maxadilano, pero en su lugar utilizan AMP y adenosina como vasodilatadores (Ribeiro et al., J. Exp. Biol 11:1551, 1999) . La adenosina es también un componente inmunomodulador que promueve la producción de IL-10 y suprime el TNF-α. y la IL-12 en ratones (Hasko et al., J. Immunol. 10:4634, 1996; Webster, Asian Pac. J. Allergy Immunol. 2:311, 1984; Hasko et al., FASEB J. 14:2065, 2000) . A pesar de lo que se sabe acerca del papel de la saliva del flebótomo y la transmisión de la enfermedad, queda mucho por saber y no existe una vacuna efectiva. Por tanto, existe una necesidad de agentes que se puedan utilizar para inducir una respuesta inmune a los organismos que causan la leishmaniasis.

Resumen La presente divulgación se refiere a proteínas salivales de vectores flebótomos Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis) y a los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Se divulgan, asimismo, métodos para producir una respuesta inmune en un sujeto.

El presente proporciona polipéptidos salivales de Lu. longipalpis sustancialmente purificados. También se divulgan polinucleótidos que codifican los polipéptidos de Lu. longipalpis.

Se proporcionan métodos para inducir una respuesta inmune utilizando una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido salival de Lu. longipalpis sustancialmente purificado divulgado en el presente, o bien el polinucleótido que codifica los polipéptidos de Lu. longipalpis divulgados en el presente. En otra realización del presente, se divulgan métodos para inhibir los síntomas de una infección por Leishmania o para prevenir la infección por Leishmania en un sujeto. Los métodos incluyen la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de Lu. longipalpis, o bien de un polinucleótido que codifica un polipéptido de Lu. longipalpis. En dos ejemplos, sin carácter limitador, se puede administrar más de un polipéptido de Lu. longipalpis, o al menos un polipéptido de Lu. longipalpis conjuntamente con un polipéptido de P. ariasi o P. perniciosus.

En el presente se divulgan asimismo métodos para diagnosticar la infección por Leishmania en un sujeto. Los métodos incluyen poner en contacto un sustrato sólido que contiene al menos tres, seis o diez polipéptidos de Lu. longipalpis, o bien un fragmento inmunogénico de los mismos, con una muestra obtenida del sujeto y detectar la unión de un componente de la muestra con al menos un polipéptido del sustrato sólido. La detección de la unión del componente con el sustrato indica que el sujeto está infectado por Leishmania.

Se divulgan composiciones farmacéuticas que incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable y un polipéptido de Lu. longipalpis.

Lo anterior y otras características y ventajas se pondrán de manifiesto más claramente en la siguiente descripción 5 detallada de diversas realizaciones, que se ofrecen con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

FIG. 1 es un conjunto de gráficos de barras que muestran los niveles de anticuerpos contra la saliva de Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis) en el suero de los individuos. Los sueros humanos se obtuvieron en el momento 0 (serología anti-Leishmania negativa (S-) o DTH negativa (DTH-) ) y 6 meses más tarde (serología anti-Leishmania positiva (S+) o DTH anti-Leishmania positiva (DTH+) ) . Se realizó un ensayo de inmunosorción enzimática (ELISA) con estos sueros utilizando la sonicación de las glándulas salivales del flebótomo Lu. longipalpis. La FIG. 1A es un gráfico de barras de los niveles de IgG anti-saliva en individuos que pasaron de S-→ S+ y los que pasaron de DTH

a DTH+. La FIG. 1B es un gráfico de barras de los niveles de IgE anti-saliva en los individuos descritos en la FIG. 1A. La FIG. 1C es un gráfico de barras de los niveles de IgGI anti-saliva en los individuos descritos en la FIG. 1A. La FIG. 1D es un gráfico de barras de los niveles de IgG4 anti-saliva en los individuos descritos en la FIG. 1A. Se empleó la prueba comparativa de Wilcoxon no paramétrica para comparar los niveles de anticuerpos contra saliva de Lu. longipalpis en el momento 0 y después de 6 meses. El valor P < 0, 05 se estableció como nivel de significación.

La FIG. 2 es un conjunto de dos imágenes digitales y un gráfico de barras que muestra proteínas salivales reconocidas mediante análisis Western blot. Las FIG. 2A y 2B son imágenes digitales de un Western blot de proteínas salivales de Lu. longipalpis que reaccionan con sueros humanos de los individuos que pasaron de S-→

S+ en Leishmania (bandas 1-6) o de DTH-→DTH+ en Leishmania (bandas 7—14) . Símbolos:— , momento 0; +, 6 meses. La FIG. 2C es un gráfico de barras de la frecuencia de proteínas salivales reconocidas por sueros de 13 individuos que pasaron de DTB-→ DTH+ en Leishmania. El eje X muestra las diferentes proteínas salivales de Lu. longipapis (etiquetadas por el peso molecular aproximado) reconocido por análisis Western blot, mientras que el eje Y indica el número de sueros humanos que reconocen una proteína salival concreta.

Listado de secuencias Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos que se recogen en el siguiente listado de secuencias se muestran utilizando las abreviaturas de letras estándar para las bases de nucleótidos y un código de tres letras para los aminoácidos, tal como se define en 37 C.F.R. 1.822. Solamente se muestra una cadena de cada secuencia de ácidos nucleicos, pero se entiende que la cadena complementaria está incluida por referencia a la cadena mostrada. En el listado de secuencias adjunto:

SEC. ID. Nº: 1 es la secuencia de aminoácidos de LJL34. SEC. ID. Nº: 2 es la secuencia de ácidos nucleicos de LJL34. SEC. ID. Nº: 3 es la secuencia de aminoácidos de LJL18. SEC. ID. Nº: 4 es la secuencia de ácidos nucleicos de LJL18. SEC. ID. Nº: 5 es la secuencia de aminoácidos de LJS193. SEC. ID. Nº: 6 es la secuencia de ácidos nucleicos de LJS193.

SEC. ID. Nº: 7 es la secuencia de aminoácidos de LJS201. SEC. ID. Nº: 8 es la secuencia de ácidos nucleicos de LJS201. SEC.... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido salival de Lu. longipalpis sustancialmente purificado, donde el polipéptido comprende

a) una secuencia de aminoácido al menos un 80% idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácido presentada como SEC. ID. Nº: 15; b) un fragmento inmunogénico, que comprende al menos ocho aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácido presentada como SEC. ID. Nº: 15, específicamente reconocido por un anticuerpo que se une de forma específica con la secuencia de aminoácido que se presenta como SEC. ID. Nº: 15; o c) la secuencia de aminoácido que se presenta como SEC. ID. Nº: 15; y donde la administración del polipéptido a un sujeto provoca una respuesta inmune a Lu. longipalpis.

2. El polipéptido de Lu. longipalpis de la reivindicación 1, donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácido que se presenta como SEC. ID. Nº: 15.

3. El polipéptido de Lu. longipalpis de las reivindicaciones 1 o 2, donde el polipéptido se compone de una secuencia de aminoácido como la que se presenta en la SEC. ID. Nº: 15.

4. Un fragmento antigénico del polipéptido de la reivindicación 3.

5. El polipéptido de la reivindicación 1, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido al menos un 80% idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácido presentada como SEC. ID. Nº: 15.

6. Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

7. El ácido nucleico de la reivindicación 6, donde el ácido nucleico comprende una secuencia como la presentada como SEC. ID. Nº: 16 o donde el ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácido al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácido presentada como SEC. ID. Nº: 16.

8. El ácido nucleico de la reivindicación 6, operativamente unido a una secuencia de control de la expresión, donde la secuencia de control de la expresión es preferiblemente un promotor, donde preferiblemente el promotor es un promotor inducible o constitutivo, donde preferiblemente el promotor es un promotor de citomegalovirus.

9. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6.

10. El vector de la reivindicación 9, donde el vector es un plásmido, o donde el vector es un vector viral.

11. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 9.

12. Un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 3 o al fragmento antigénico de la reivindicación 4.

13. El anticuerpo de la reivindicación 12, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

14. El anticuerpo de la reivindicación 13, que comprende una etiqueta detectable, donde preferiblemente la etiqueta es una etiqueta fluorescente, enzimática o radiactiva.

15. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable; o una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Un polipéptido salival de Lu. longipalpis sustancialmente purificado seleccionado del grupo compuesto por:

a) una secuencia de aminoácido al menos un 80% idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácido presentada como SEC. ID. Nº: 15. b) un fragmento inmunogénico, que comprende al menos ocho aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácido presentada como SEC. ID. Nº: 15, específicamente reconocido por un anticuerpo que se une de forma específica con la secuencia de aminoácido que se presenta como SEC. ID. Nº: 15; o c) la secuencia de aminoácido presentada como SEC. ID. Nº: 15; para su uso en la inducción de una respuesta inmune a un polipéptido de Lu. longipalpis en un sujeto.

17. Un polinucleótido que codifica el polipéptido que se presenta en las letras a) , b) o c) de la reivindicación 16, para su uso en la inducción de una respuesta inmune a un polipéptido de Lu. longipalpis en un sujeto.

18. El polipéptido de la reivindicación 16 o el polinucleótido de la reivindicación 17, donde la respuesta inmune es una respuesta de linfocitos T o donde la respuesta inmune es una respuesta de linfocitos B.

19. El polipéptido de la reivindicación 16 o el polinucleótido de la reivindicación 17, donde el sujeto es un sujeto veterinario no humano o donde el sujeto veterinario no humano es un perro.

20. El polipéptido de la reivindicación 16 o el polinucleótido de la reivindicación 17, donde el sujeto es un ser humano.

21. Un polipéptido salival de Lu. longipalpis sustancialmente purificado seleccionado del grupo compuesto por:

a) una secuencia de aminoácido al menos un 80% idéntica a la longitud total de la secuencia de aminoácido presentada como SEC. ID. Nº: 15; b) un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácido que se presenta como SEC. ID. Nº: 15, específicamente reconocido por un anticuerpo que se une de forma específica con la secuencia de aminoácido que se presenta como SEC. ID. Nº: 15; o c) la secuencia de aminoácido presentada como SEC. ID. Nº: 15; para su uso en la inhibición de un síntoma de una infección por Leishmania o en la prevención de una infección por Leishmania en un sujeto.

22. Un polinucleótido que codifica el polipéptido que se presenta en las letras a) , b) o c) de la reivindicación 21, para su uso en la inhibición de un síntoma de una infección por Leishmania o en la prevención de una infección por Leishmania en un sujeto.

23. Uso de una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 o un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento.

24. Uso de una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 o un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 1 conjuntamente con una composición que comprende un polipéptido de P. ariasi o

P. perniciosus para la fabricación de un medicamento.

25. Un método para diagnosticar la infección por Leishmania en un sujeto, que consiste en:

poner en contacto un sustrato sólido con una muestra obtenida del sujeto, donde el sustrato sólido contiene un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido presentada como SEC. ID. Nº: 15 o un fragmento inmunogénico del mismo; detectar la unión de un componente de la muestra a dicha secuencia del polipéptido en el sustrato sólido, donde la detección de la unión del componente al sustrato indica que el sujeto está infectado por Leishmania, diagnosticando así la infección por Leishmania en el sujeto.

26. El método de la reivindicación 25, donde el sustrato sólido comprende una perla, una partícula, una membrana o una placa de poliestireno; o donde la detección consiste poner en contacto el componente unido al sustrato sólido con un anticuerpo secundario etiquetado.

27. El polipéptido de la reivindicación 1, donde el polipéptido está codificado por los residuos de ácido nucleico 115948 de la SEC. ID. Nº: 16 o los residuos de ácido nucleic.

4. 948 de la SEC. ID. Nº: 16.

ººººººººººººººº