Polipéptido con una actividad de fitasa y secuencia de nucleótidos que codifica éste.

Molécula de ADN recombinante, que, después de su expresión en una célula anfitriona procariótica o eucariótica,

codifica un polipéptido con una actividad de fitasa, conteniendo la molécula de ADN recombinante una secuencia deADN, que se escoge entre

a) unas secuencias de ADN, que se han obtenido mediante variaciones de la secuencia de la fitasa madura de E.coli de tipo silvestre, teniendo las secuencias de ADN por lo menos una mutación, que se escoge entre elconjunto formado por Val 200 → Leu, Val 200 → Ile, Val 200 → Pro, Val 200 → Tyr, Leu 207 → Tyr y Leu 207→ Phe,

b) unas secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, están emparentadas con lassecuencias de acuerdo con a),realizándose que la molécula de ADN recombinante, en el caso de su expresión en una adecuada célula anfitriona,va acompañada por una actividad aumentada de la proteína codificada de esta manera en el material sobrenadantedel cultivo.

Polipéptido con una actividad de fitasa y secuencia de nucleótidos que codifica éste El invento se refiere a una molécula de ADN recombinante, que codifica un polipéptido con una actividad de fitasa, así como al polipéptido codificado como tal. En particular, el invento se refiere a una molécula de ADN recombinante, que codifica un polipéptido con una actividad de fitasa, habiéndose obtenido la secuencia de ADN mediante una variación de la fitasa de E. coli madura de tipo silvestre, habiendo sido modificadas unas posiciones definidas de aminoácidos en comparación con la secuencia de tipo silvestre. El invento se refiere además a un procedimiento para la expresión de la fitasa recombinante así como a su utilización en la tecnología de los alimentos y piensos.

El ácido fítico o 1, 2, 3, 4, 5, 6-hexaquis-dihidrógenofosfato de mioinositol (denominado abreviadamente hexaquisfosfato de mioinositol) es la fuente principal de inositol y la forma primaria de almacenamiento de fosfato en semillas de plantas. En las semillas de leguminosas, aproximadamente un 70 % del contenido de fosfato se presenta como una sal mixta de potasio, magnesio y calcio del ácido fítico. Las semillas, los granos de cereales y las leguminosas son unos componentes importantes de formulaciones de alimentos y piensos, en particular de preparados de piensos para animales; pero también en la alimentación humana van ganando crecientemente en importancia los cereales y las leguminosas.

Las unidades de fosfato del ácido fítico (PPU, acrónimo de Phytic acid Phosphate Units) fijan en forma de un complejo a ciertos cationes divalentes y trivalentes tales como iones de metales, es decir a unos iones importantes desde el punto de vista fisiológico nutritivo tales como calcio, hierro, zinc y magnesio, así como a los elementos traza manganeso, cobre y molibdeno. Junto a esto, el ácido fítico fija también proteínas hasta una cierta medida mediante una interacción electrostática.

El ácido fítico y sus sales, los fitatos, frecuentemente no se metabolizaban, puesto que no se absorben desde el tracto gastrointestinal, es decir que ni el fósforo allí contenido ni los iones de metales quelatados, ni las proteínas fijadas están disponibles desde el punto de vista fisiológico de nutrición.

Puesto que el fósforo es un elemento esencial para el crecimiento de todos los organismos, los alimentos y piensos tienen que ser suplementados con un fosfato inorgánico. Muy frecuentemente también tienen que ser suplementados los iones esenciales desde el punto de vista fisiológico de nutrición, tales como los de hierro y calcio. Además, se reduce el valor fisiológico de nutrición de cualquier dieta, puesto que las proteínas son fijadas por el ácido fítico. Como consecuencia, el ácido fítico es designado frecuentemente como un factor anti-valor nutritivo.

Además, debido a la ausencia de una metabolización del ácido fítico, el fósforo del fitato es segregado a través del tracto gastrointestinal de los animales, lo que conduce a una indeseada impurificación por fosfato del medio ambiente, como consecuencia de lo cual puede llegarse, por ejemplo, a una eutrofización de las aguas y a un crecimiento excesivo de las algas.

El ácido fítico o los fitatos (estas expresiones son utilizadas en lo sucesivo como sinónimas excepto que se indique otra cosa distinta) pueden ser degradados por unas fitasas. Las semillas de plantas que contienen ácido fítico, contienen unas enzimas fitasas endógenas. En el caso de su asimilación, los fitatos que se encuentran en alimentos o respectivamente piensos, son hidrolizables en teoría por las fitasas endógenas de las plantas, por unas fitasas procedentes de la flora intestinal y por unas fitasas procedentes de la mucosa intestinal. Sin embargo, en la práctica el potencial de hidrólisis de las fitasas endógenas de plantas y de las fitasas que se presentan en el intestino, siempre y cuando que estén presentes, no es suficiente ni con mucho para garantizar de una manera significativa la biodisponibilidad del fósforo fijado en los fitatos. Por lo tanto, a los alimentos o respectivamente piensos se les añaden frecuentemente unas fitasas exógenas.

Las fitasas pueden ser producidas por plantas así como por microorganismos. Entre los microorganismos, se conocen unas bacterias que producen fitasas así como unos hongos y unas levaduras que producen fitasas.

Los productores de fitasas que se presentan en la naturaleza tienen sin embargo la desventaja, de que se forma una fitasa sólo en determinadas cantidades y con unas propiedades definidas. Sin embargo, tal como se ha expuesto precedentemente, subsiste una necesidad aumentada de una fitasa en particular para la industria de los alimentos y piensos.

El presente invento se basa por consiguiente en la misión de poner a disposición un polipéptido con una actividad de fitasa, que se pueda producir de una manera rentable. En particular, la fitasa debe de poder ser producida a un precio barato. La fitasa debe de conservar, además, las propiedades esenciales de la fitasa natural de tipo silvestre de E. coli, pero debe de distinguirse por una actividad aumentada en el material sobrenadante del cultivo o respectivamente por una segregabilidad mejorada. Entre las propiedades esenciales de la fitasa natural de tipo silvestre se cuentan en particular la capacidad de mejorar la disponibilidad de fosfato in vivo e in vitro, así como la idoneidad como un agente coadyuvante de panificación.

El presente invento se basa, además, en la misión de poner a disposición un gen para un polipéptido con una actividad de fitasa, que en el caso de una expresión en una célula anfitriona tenga como consecuencia una actividad aumentada de la proteína codificada de esta manera en el material sobrenadante del cultivo o respectivamente una secreción aumentada del polipéptido. El polipéptido debe de ser producido de una manera rentable y a un precio barato. En particular, la expresión del polipéptido debe de conducir a unos rendimientos más altos en microorganismos eucarióticos, comparada con la expresión de la fitasa de tipo silvestre. Además, se deben de poner a disposición las secuencias de ADN que codifican el polipéptido, unas correspondientes construcciones artificiales de ADN y unos vectores, así como una fuente para la enzima recombinante, que sea apropiada para la utilización comercial para alimentos y piensos y en procesos industriales, y unas composiciones que contengan la enzima conforme al invento.

Por fin, se encontró sorprendentemente que una mutación en la región desde el aminoácido 189 inclusive hasta el aminoácido 211 inclusive y/o desde el aminoácido 137 inclusive hasta el aminoácido 152 inclusive de la fitasa de tipo silvestre de E. coli conduce a una actividad aumentada en el material sobrenadante del cultivo total por la proteína fitasa sin perjudicar a los efectos ventajosos y a las propiedades esenciales de la fitasa de tipo silvestre de E. coli.

Se han descrito varias fitasas procedentes de E. coli en la bibliografía, p.ej. en la cita de Dassa y colaboradores, 1990,

J. Bacteriol. 172: 5497-5500 (n° de acceso M58708) . Ya fueron asimismo descritos unos mutantes modificados genéticamente de la fitasa de E. coli, los cuales conducían a una estabilidad térmica aumentada y/o a unas actividades específicas más altas (véanse Rodríguez y colaboradores, 2000, Arch. Biochem. Biophys., 382:105-112, Lanahan y colaboradores, 2003, el documento de solicitud de patente de los EE.UU. US 2003 0157646 A1 y el documento de solicitud de patente internacional WO 01/90333) . Una mutagénesis específica para un sitio de la fitasa de Escherichia coli con unas propiedades enzimáticas mejoradas se ha descrito además en el documento WO 01/36607. El mutante con Val-Tyr descrito aquí en la posición 200 no corresponde, sin embargo, a la mutación en la posición 200 conforme al invento, puesto que, de acuerdo con el documento WO 01/36607, se había utilizado otro modo de recuento de la secuencia, es decir que se había incluido en el recuento la secuencia directora. La posición 222 en la secuencia de acuerdo con esta publicación (WO 01/36607) corresponde por consiguiente a la posición 200 del recuento conforme al invento. Otras proteínas con una actividad de fitasa se han divulgado en los documentos WO 99/08539, WO 01/90333, WO 02/095003, WO 03/038035, WO 03/038111, WO 04/015084 y WO 00/71728.

Además, la publicación de Garret y colaboradores: Applied Environ. Microbiol. 2004, 70 (5) , 3041-3046 describe unos mutantes de la fitasa de E. coli con una aumentada estabilidad térmica y gastrointestinal.

El estado de la técnica no contiene sin embargo ninguna descripción acerca de unas mutaciones en la fitasa... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ADN recombinante, que, después de su expresión en una célula anfitriona procariótica o eucariótica, codifica un polipéptido con una actividad de fitasa, conteniendo la molécula de ADN recombinante una secuencia de ADN, que se escoge entre a) unas secuencias de ADN, que se han obtenido mediante variaciones de la secuencia de la fitasa madura de E. coli de tipo silvestre, teniendo las secuencias de ADN por lo menos una mutación, que se escoge entre el conjunto formado por Val 200 - Leu, Vai 200 -lie, Vai 200 - Pro, Vai 200 - Tyr, Leu 207 - Tyr y Leu 207

-Phe,

b) unas secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, están emparentadas con las secuencias de acuerdo con a) ,

realizándose que la molécula de ADN recombinante, en el caso de su expresión en una adecuada célula anfitriona, va acompañada por una actividad aumentada de la proteína codificada de esta manera en el material sobrenadante del cultivo.

2. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque ella posee la secuencia SEQ lD NO: 1.

3. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 2, caracterizada porque ella comprende además una secuencia de señal derivada del gen de la fitasa de Aspergillus niger con la secuencia SEQ lD NO: 3.

4. Polipéptido, que posee una actividad de fitasa y que es codificado por una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 3 o que se obtiene mediante expresión de una célula anfitriona transformada con ésta.

5. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque él posee ia secuencia SEQ lD NO: 2.

6. Construcción artificial de ADN con la capacidad para, después la introducción en una célula anfitriona adecuada, regular la expresión de un gen de fitasa mutado en un anfitrión, caracterizada porque ella contiene eventualmente un promotor, eventualmente unas secuencias de señal y de marcación, una secuencia de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 2, un terminador y eventualmente unas secuencias flanqueadoras en 5' y 3'.

7. Construcción artificial de ADN de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque en el caso del promotor se trata dei promotor de ia ceiobiohidroiasa l, de ia ceiobiohidroiasa ll, de la amilasa, de la glucoamilasa, de la xilanasa

o de la enolasa.

8. Construcción artificial de ADN de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque en el caso de la secuencia de señal se trata de una secuencia de señal de fitasa eventualmente modificada procedente de Aspergillus niger, de manera preferida de ia secuencia SEQ lD NO: 3.

9. Vector con la capacidad de transformar a una célula anfitriona, caracterizado porque él contiene una construcción artificial de acuerdo con la reivindicación 6.

10. Vector de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque él es el plásmido Da2pUC3, presentado bajo el número de presentación DSM 16396.

11. Célula anfitriona transformada, escogida entre hongos, levaduras, bacterias y células de mamíferos, que contiene una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 3, y que está dotada de la capacidad de expresar un polipéptido con una actividad de fitasa.

12. Célula anfitriona transformada de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada porque ella pertenece al género Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor o Penicillium.

13. Procedimiento para la producción de una fitasa, caracterizado porque se cultiva una célula anfitriona transformada de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 en unas condiciones, que son favorables para la formación de la fitasa, y se aísla la fitasa producida de esta manera.

14. Composición, que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, eventualmente en común con otras sustancias auxiliares y/o activas.

15. Composición de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizada porque ella es una composición de alimento o pienso.

16. Composición de acuerdo con la reivindicación 14, estando caracterizada esta composición porque es un agente 5 de panificación.

17. Utilización de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 para la producción de un preparado destinado al mejoramiento del aprovechamiento de fosfato a partir de la nutrición en los casos de animales y seres humanos.

18. Utilización de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 para el mejoramiento de las propiedades reológicas de unas masas de panificación destinadas a la producción de productos de panificación.