Polipéptido con actividad de fitasa y estabilidad térmica incrementada de la actividad enzimática, así como secuencia de nucleótidos que codifica a este polipéptido.

Molécula de ADN recombinante que, después de su expresión en una célula hospedadora procariótica oeucariótica,

codifica un polipéptido con actividad de fitasa, conteniendo la molécula de ADN recombinante unasecuencia de ADN, seleccionada entre

a) secuencias de ADN que codifican un polipéptido con una actividad de fitasa, que se habíaobtenido mediante variación de la secuencia de la fitasa madura de E. coli de tipo salvaje,comprendiendo la variación la mutación lisina &rrar; ácido aspártico en la posición 74 (K74D),

b) secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, están emparentadas conlas secuencias de acuerdo con a),

en donde la molécula de ADN recombinante, en el caso de su expresión en una adecuada célula hospedadora, vaacompañada de unas estabilidades térmica y frente a proteasas incrementadas de la actividad enzimática de laproteína así codificada.

Polipéptido con actividad de fitasa y estabilidad térmica incrementada de la actividad enzimática, así como secuencia de nucleótidos que codifica a este polipéptido La invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que codifica un polipéptido con actividad de fitasa y estabilidad térmica incrementada y estabilidad proteolítica incrementada de la actividad enzimática, así como al polipéptido codificado como tal. En particular, la invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que codifica un polipéptido con actividad de fitasa y estabilidad térmica incrementada y estabilidad proteolítica incrementada de la actividad enzimática, habiendo sido obtenida la secuencia de ADN mediante una variación de la fitasa de E. coli de tipo salvaje madura, en donde posiciones de aminoácidos definidas están modificadas en comparación con la secuencia de tipo salvaje o bien están presentes extensiones N-y/o C-terminales. La invención se refiere, además, a un procedimiento para la expresión de la fitasa recombinante, así como a su uso en la tecnología alimentaria y de alimentos para animales.

Ácido fítico o mioinositol-1, 2, 3, 4, 5, 6-hexaquisdihidrogenofosfato (abreviado mioinositol-hexaquisfosfato) es la fuente principal de inositol y la forma de almacenamiento primaria de fosfato en semillas de vegetales. En las semillas de leguminosas, aproximadamente el 70% del contenido en fosfato se presenta en forma de una sal de potasio, magnesio y calcio mixta del ácido fítico. Semillas, granos de cereales y leguminosas son componentes importantes de preparados alimentarios y de alimentos para animales, en particular de preparados de piensos para animales; pero también en la alimentación humana los cereales y las leguminosas adquieren importancia de forma creciente.

Las unidades fosfato del ácido fítico ligan en forma de complejo cationes divalentes y trivalentes tales como iones de metales, es decir, iones importantes para la fisiología nutricional tales como calcio, hierro, zinc y magnesio, así como los oligoelementos manganeso, cobre y molibdeno. Junto a ello, en cierta medida, el ácido fítico liga también proteínas mediante interacción electrostática.

El ácido fítico y sus sales, los fitatos, no son a menudo metabolizados, dado que no son absorbidos por el tracto gastrointestinal, es decir, ni el fósforo contenido en ellos ni los iones de metales quelados ni las proteínas fijadas están disponibles desde un punto de vista fisiológico nutricional.

Dado que el fósforo es un elemento esencial para el desarrollo de todos los organismos, los alimentos y alimentos para animales deben ser suplementados con fosfato inorgánico. Muy a menudo, también deben ser suplementados los iones esenciales para la fisiología nutricional tales como hierro y calcio. Además, el valor fisiológico nutricional de cada dieta disminuye, dado que las proteínas son fijadas por parte del ácido fítico. Como consecuencia. el ácido fítico se designa a menudo como factor anti-nutricional.

Además, en virtud de un metabolismo carente del ácido fítico, el fósforo del fitato es segregado a través del tracto gastrointestinal de los animales, lo cual conduce a una contaminación indeseada con fosfatos del medio ambiente, como consecuencia de la cual se puede producir, por ejemplo, la eutrofización de las aguas y un desarrollo excesivo de algas.

Ácido fítico o fitatos (estas expresiones se utilizan en lo que sigue de manera sinónima, a no ser que se indique de otro modo) pueden ser degradados por parte de fitasas. Las fitasas catalizan la hidrólisis de fitato en mino-inositol y/o mono-, di-, tri-, tetra- y/o penta-fosfatos así como fosfato inorgánico. Se diferencian dos tipos distintos de fitasas microbianas: 1) 3-fitasa/mio-inositolhexafosfato-3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8; 2) 6-fitasa/mioinositolhexafosfato-6-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.26. La 3-fitasa hidroliza preferiblemente primero el enlace éster en la posición 3, la 6-fitasa hidroliza preferiblemente primero el enlace éster en la posición 6. Semillas de vegetales con contenido en ácido fítico contienen enzimas fitasa endógenas. En su absorción, los fitatos en alimentos o bien alimentos para animales pueden ser hidrolizados teóricamente por parte de las fitasas de vegetales endógenas, por parte de fitasas de la flora intestinal y por parte de fitasas de la mucosa intestinal. En la práctica, sin embargo, el potencial de hidrólisis de las fitasas vegetales endógenas y de las fitasas que se presentan en el intestino, en la medida en que estén presentes, no son con mucho suficientes como para garantizar de manera significativa la biodisponibilidad del fósforo ligado en los fitatos. Por lo tanto, a los alimentos o a alimentos para animales se les añade a menudo fitasas exógenas.

Las fitasas pueden ser producidas por plantas así como por microorganismos. Entre los microorganismos se conocen bacterias productoras de fitasa, así como hongos y levaduras productores de fitasa.

Los productores de fitasa que se presentan de forma natural tienen, sin embargo, el inconveniente de que la fitasa sólo puede ser formada en determinadas cantidades y con propiedades definidas. Tal como se expone precedentemente, existe, sin embargo, una demanda incrementada de fitasa, en particular para la industria alimentaria y de alimentos para animales.

A pesar de en que la industria alimentaria y de alimentos para animales existe una demanda incrementada de fitasa y el uso de fitasa puede ser ventajoso, sólo unas pocas de las fitasas conocidas han encontrado una amplia aceptación en la industria alimentaria y de alimentos para animales. Consideraciones típicas se refieren a los costes de preparación relativamente elevados y/o a la mala estabilidad o bien actividad de la enzima en el entorno de aplicación deseado. Además de ello, una enzima de este tipo debe cumplir una serie de criterios con el fin de poder ser empleada en la industria. Éstos comprenden una elevada actividad total específica, un óptimo de pH bajo, resistencia frente a proteasas gastrointestinales, así como estabilidad térmica o bien termoestabilidad. La estabilidad térmica es una premisa importante para una aplicación industrial exitosa, dado que, por ejemplo en procesos de granulación, las enzimas son expuestas a temperaturas entre 60ºC y 95ºC.

Todas las fitasas microbianas conocidas se despliegan a temperaturas entre 56ºC y 78ºC (Lehman et al., 2000) , con lo cual pierden su actividad. Por lo tanto, existe en particular una demanda de fitasas que, también a temperaturas elevadas, posean una actividad tecnológicamente suficiente o bien no sean inactivadas.

Por consiguiente, la presente invención se basa en el cometido de habilitar un polipéptido con actividad de fitasa que presente una termoestabilidad incrementada o bien que posea una actividad tecnológicamente suficiente a temperaturas elevadas. Además, el polipéptido con actividad de fitasa debe poseer también una estabilidad proteolítica incrementada.

El polipéptido ha de poder ser producido de forma rentable. En particular, la fitasa debe ser más termoestable que la enzima de tipo salvaje. Además, la fitasa debe conservar las propiedades esenciales de la fitasa de tipo salvaje de E. coli natural, pero debe distinguirse por una termoestabilidad mejorada. A las propiedades esenciales de la fitasa de tipo salvaje natural pertenecen, en particular, la capacidad de mejorar la disponibilidad de fosfato in-vivo e in-vitro mediante su actividad como fitasa, al igual que como fosfatasa, su óptimo del pH en el intervalo ácido con una actividad residual en el intervalo fuertemente ácido, así como su idoneidad como coadyuvante de panificación.

La presente invención se basa, además, en la misión de poner a disposición un gen para un polipéptido con actividad de fitasa con termoestabilidad incrementada así como estabilidad proteolítica incrementada. El polipéptido ha de poder ser producido de forma rentable y económica. En particular, la expresión del polipéptido en microorganismos eucarióticos ha de conducir a un polipéptido con termoestabilidad incrementada en comparación con la fitasa de tipo salvaje producida de manera similar. Se han de proporcionar, además, las secuencias de ADN codificadoras del polipéptido, construcciones de ADN y vectores correspondientes, así como una fuente para la enzima recombinante que sea adecuada para el uso comercial para alimentos y alimentos para animales y en procesos industriales, y composiciones que contengan a la enzima de acuerdo con la invención.

Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que mutaciones en determinadas posiciones de la secuencia de fitasa de tipo salvaje de E. coli conducen a un aumento intrínseco de la termoestabilidad... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ADN recombinante que, después de su expresión en una célula hospedadora procariótica o eucariótica, codifica un polipéptido con actividad de fitasa, conteniendo la molécula de ADN recombinante una 5 secuencia de ADN, seleccionada entre a) secuencias de ADN que codifican un polipéptido con una actividad de fitasa, que se había obtenido mediante variación de la secuencia de la fitasa madura de E. coli de tipo salvaje, comprendiendo la variación la mutación lisina → ácido aspártico en la posición 74 (K74D) ,

b) secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, están emparentadas con las secuencias de acuerdo con a) ,

en donde la molécula de ADN recombinante, en el caso de su expresión en una adecuada célula hospedadora, va acompañada de unas estabilidades térmica y frente a proteasas incrementadas de la actividad enzimática de la 15 proteína así codificada.

2. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la secuencia de ADN comprende adicionalmente la variación V200P del polipéptido codificado.

3. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la secuencia de ADN comprende adicionalmente las variaciones L145I y L198I del polipéptido codificado.

4. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que como adición Nterminal del polipéptido codificado comprende la secuencia FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY

GGNGPYSERV SYGIARDPPTS, y/o como adición C-terminal del polipéptido codificado comprende la secuencia LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD.

5. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que comprende una secuencia escogida entre las secuencias SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 17. 30

6. Polipéptido, que posee una actividad de fitasa y que es codificado por una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 o que se obtiene mediante expresión de una célula hospedadora transformada con ésta.

7. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que comprende una secuencia escogida entre las SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:18.

8. Construcción de ADN con la capacidad para regular la expresión de un gen de fitasa mutado en un hospedador,

después de la introducción en una célula hospedadora adecuada, caracterizada por que contiene una secuencia 40 de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 y un terminador.

9. Construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada por que posee secuencias flanqueantes en 5' y 3', un promotor y/o secuencias de señal y de marcador.

10. Construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada por que en el caso del promotor se trata del promotor de la celobiohidrolasa I, de la celobiohidrolasa II, de la amilasa, de la glucoamilasa, de la xilanasa o de la enolasa.

11. Construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, caracterizada por que en el caso de la secuencia 50 de señal y/o de las secuencias flanqueantes en 5' y 3' se trata de las secuencias de señal de la fitasa de Aspergillus niger.

12. Construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada por que en el caso de las secuencias de señal de la fitasa de Aspergillus niger se trata de secuencias de señal modificadas de la fitasa de Aspergillus 55 niger.

13. Vector con la capacidad de transformar a una célula hospedadora, caracterizado por que el vector contiene una construcción de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 12.

14. Vector de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que se escoge entre el plásmido pET-PhyM7, depositado bajo el número de depósito DSM 18716 o el plásmido pUC-PhyM10, depositado bajo el número de depósito DSM 18719.

15. Célula hospedadora transformada escogida entre hongos, levaduras, bacterias y células de mamíferos, que contiene una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, y que está dotada de la capacidad de expresar un polipéptido con actividad de fitasa.

16. Célula hospedadora transformada de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada por que pertenece al

género Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor o Penicillium. 10

17. Procedimiento para la producción de fitasa, caracterizado por que se cultiva una célula hospedadora transformada de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16 en condiciones que fomentan la formación de fitasa, y se aísla la fitasa así producida.

18. Composición, que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, eventualmente junto con otros coadyuvantes y/o sustancias activas.

19. Composición de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizada por que la composición es una composición de alimento o de alimento para animales o un agente de panificación. 20

20. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19 para la producción de un preparado destinado a la mejora del aprovechamiento de fosfato a partir de la nutrición en animales y seres humanos o para la mejora de las propiedades reológicas de masas de panificación destinadas a la producción de productos de panificación.

21. Uso de una variación de la secuencia de la fitasa de E. coli madura de tipo salvaje, que comprende la mutación lisina → ácido aspártico en la posición 74 (K74D) para la producción de una molécula de ADN recombinante que, después de su expresión en una célula hospedadora procariótica o eucariótica, codifica un polipéptido con una actividad de fitasa, que posee unas estabilidades térmica y frente a proteasas incrementadas.

22. Uso de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizado por que el uso tiene lugar junto con las variaciones L145I y L198I.

23. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado por que el uso tiene lugar junto con la variación V200P.

24. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado por que el uso tiene lugar junto con la variación de la adición N-terminal de la secuencia FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS y/o la variación de la adición C-terminal de la secuencia LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD.