Polipéptido con una actividad de fitasa y una aumentada estabilidad térmica de la actividad enzimática, así como una secuencia de nucleótidos que codifica éste.

Molécula de ADN recombinante, que, después de su expresión en una célula anfitriona procariótica o eucariótica,

codifica un polipéptido con una actividad de fitasa, conteniendo la molécula de ADN recombinante una secuencia deADN, que se escoge entre

a) unas secuencias de ADN, que codifican un polipéptido con una actividad de fitasa, que se había obtenidomediante variación de la secuencia de la fitasa madura de E. coli de tipo silvestre, comprendiendo lavariación una combinación de las mutaciones asparagina → arginina en la posición 139 (N139R) y ácido aspártico → ácido glutámico en la posición 142 (D142E),

b) unas secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, están emparentadas con lassecuencias de acuerdo con a),

realizándose que la molécula de ADN recombinante, en el caso de su expresión en una adecuada célula anfitriona,va acompañada por unas estabilidades térmica y frente a proteasas aumentadas de la actividad enzimática de laproteína codificada de esta manera.

Polipéptido con una actividad de fitasa y una aumentada estabilidad térmica de la actividad enzimática, así como una secuencia de nucleótidos que codifica éste El invento se refiere a una molécula de ADN recombinante, que codifica un polipéptido con una actividad de fitasa y con una estabilidad térmica aumentada y una estabilidad proteolítica aumentada de la actividad enzimática, así como al polipéptido codificado como tal. En particular, el invento se refiere a una molécula de ADN recombinante, que codifica un polipéptido con una actividad de fitasa y con una estabilidad térmica aumentada y una estabilidad proteolítica aumentada de la actividad enzimática, habiéndose obtenido la secuencia de ADN mediante una variación de la fitasa de E. coli madura de tipo silvestre, habiendo sido modificadas unas posiciones definidas de aminoácidos en comparación con la secuencia de tipo silvestre (wt, acrónimo de wild type) , o respectivamente estando presentes unas extensiones (= prolongaciones) en los extremos terminales de N y/o C. El invento se refiere además a un procedimiento para la expresión de la fitasa recombinante así como a su utilización en la tecnología de los alimentos y piensos.

El ácido fítico o 1, 2, 3, 4, 5, 6-hexaquis-dihidrógenofosfato de mioinositol (denominado abreviadamente hexaquisfosfato de mioinositol) es la fuente principal de inositol y la forma primaria de almacenamiento de fosfato en semillas de plantas. En las semillas de leguminosas, aproximadamente un 70 % del contenido de fosfato se presenta como una sal mixta de potasio, magnesio y calcio del ácido fítico. Las semillas, los granos de cereales y las leguminosas son unos componentes importantes de formulaciones de alimentos y piensos, en particular de preparados de piensos para animales; pero también en la nutrición humana van ganando crecientemente en importancia los cereales y las leguminosas.

Las unidades de fosfato del ácido fítico fijan en forma de un compuesto complejo a ciertos cationes divalentes y trivalentes tales como iones de metales, es decir a unos iones importantes desde el punto de vista fisiológico nutritivo, tales como los de calcio, hierro, zinc y magnesio, así como a los elementos traza (oligoelementos) manganeso, cobre y molibdeno. Junto a esto, el ácido fítico fija también proteínas hasta una cierta medida mediante una interacción electrostática.

El ácido fítico y sus sales, los fitatos, frecuentemente no se metabolizan, puesto que no son absorbidos/as desde el tracto gastrointestinal, es decir que ni el fósforo allí contenido ni los iones de metales quelatados, ni las proteínas fijadas están disponibles desde el punto de vista fisiológico de nutrición.

Puesto que el fósforo es un elemento esencial para el crecimiento de todos los organismos, los alimentos y piensos tienen que ser suplementados con un fosfato inorgánico. Muy frecuentemente también tienen que ser suplementados los iones esenciales desde el punto de vista fisiológico de nutrición, tales como los de hierro y calcio. Además, se disminuye el valor fisiológico de nutrición de cualquier dieta, puesto que las proteínas son fijadas por el ácido fítico. Como consecuencia, el ácido fítico es designado frecuentemente como un factor anti-valor nutritivo.

Además, debido a la ausencia de una metabolización del ácido fítico, el fósforo del fitato es segregado a través del tracto gastrointestinal de los animales, lo que conduce a una indeseada impurificación por fosfato del medio ambiente, como consecuencia de lo cual puede llegarse, por ejemplo, a una eutrofización de las aguas y a un crecimiento excesivo de las algas.

El ácido fítico o los fitatos (estas expresiones son utilizadas en lo sucesivo como sinónimas, excepto que se indique otra cosa distinta) pueden ser degradados por las fitasas. Las fitasas catalizan la hidrólisis de un fitato para dar mioinositol y/o mono-, di-, tri-, tetra- y/o pentafosfatos así como un fosfato inorgánico. Se establece diferencia entre dos tipos diferentes de fitasas microbianas: 1) la 3-fitasa/mioinositolhexafosfato-3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8; 2) la 6fitasa/mioinositolhexafosfato-6-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.26. La 3-fitasa hidroliza de manera preferida en primer lugar al enlace de éster en la posición 3, y la 6-fitasa hidroliza de manera preferida en primer lugar al enlace de éster en la posición 6. Las semillas de plantas que contienen ácido fítico, contienen también unas enzimas fitasas endógenas. En el caso de su asimilación, los fitatos que se encuentran en alimentos o respectivamente piensos, son hidrolizables en teoría por las fitasas endógenas de las plantas, por unas fitasas procedentes de la flora intestinal y por unas fitasas procedentes de la mucosa intestinal. Sin embargo, en la práctica el potencial de hidrólisis de las fitasas endógenas de las plantas y de las fitasas que se presentan en el intestino, siempre y cuando que éstas estén presentes, no es suficiente ni con mucho para garantizar de una manera significativa la biodisponibilidad del fósforo combinado en los fitatos. Por lo tanto, a los alimentos o respectivamente piensos se les añaden frecuentemente unas fitasas exógenas.

Las fitasas pueden ser producidas por plantas así como por microorganismos. Entre los microorganismos, se conocen unas bacterias que producen fitasas así como unos hongos y unas levaduras que producen fitasas.

Los productores de fitasas que se presentan en la naturaleza tienen, sin embargo, la desventaja, de que se forma una fitasa sólo en determinadas cantidades y con unas propiedades definidas. Sin embargo, tal como se ha expuesto precedentemente, subsiste una necesidad aumentada de una fitasa en particular para la industria de los alimentos y piensos.

A pesar de que en la industria de los alimentos y piensos subsiste una necesidad aumentada de fitasas y de que la utilización de una fitasa puede ser ventajosa, solamente unas pocas de las fitasas conocidas han encontrado una amplia aceptación en la industria de los alimentos y piensos. Unos típicos reparos se refieren a los costes de producción relativamente altos y/o a la mala estabilidad o respectivamente actividad de la enzima en el entorno deseado de uso. Por lo demás, una enzima de este tipo debe de cumplir una serie de criterios, con el fin de serempleable industrialmente. Éstos comprenden una alta actividad global específica, un bajo valor óptimo del pH, una resistencia frente a las proteasas gastrointestinales así como una estabilidad térmica o respectivamente termoestabilidad. La estabilidad térmica es una premisa importante para un uso industrial exitoso, puesto que, por ejemplo en los procesos de granulación, las enzimas son sometidas a unas temperaturas comprendidas entre 60ºC y 95ºC.

Todas las fitasas microbianas conocidas se despliegan a unas temperaturas comprendidas entre 56ºC y 78ºC (Lehman y colaboradores, 2000) , con lo cual ellas pierden su actividad. Por ello, subsiste en particular una necesidad de unas fitasas, que también a unas temperaturas elevadas posean una actividad suficiente desde el punto de vista tecnológico, o respectivamente que no sean desactivadas.

El documento de solicitud de patente internacional WO 01/90333 se refiere a un procedimiento para el mejoramiento del valor nutritivo de un pienso que contiene fitato, siendo puesto en contacto este pienso con una enzima fitasa que tiene una secuencia definida. Esta fitasa posee una estabilidad térmica aumentada.

El presente invento se basa por consiguiente en la misión de poner a disposición un polipéptido con una actividad de fitasa, que tenga una termoestabilidad aumentada o respectivamente que, a unas temperaturas aumentadas, posea una actividad suficiente desde el punto de vista tecnológico. Además, el polipéptido con una actividad de fitasa debe de poseer también una estabilidad proteolítica aumentada.

El polipéptido debe de poder producirse de una manera rentable. En particular, la fitasa debe de ser más estable térmicamente que la enzima de tipo silvestre. La fitasa debe de conservar, además, las propiedades esenciales de la fitasa natural de tipo silvestre de E. coli, pero debe de distinguirse por una termoestabilidad mejorada. Entre las propiedades esenciales de la fitasa natural de tipo silvestre se cuentan en particular la capacidad de mejorar la disponibilidad de fosfato in vivo e in vitro mediante su actividad como fitasa así como también como fosfatasa, su valor óptimo del pH en el entorno ácido, con una alta actividad residual en un entorno fuertemente ácido, así como la idoneidad como un agente coadyuvante de panificación.

El presente invento se basa, además, en la misión de poner a disposición un gen para un polipéptido con una actividad de fitasa,... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ADN recombinante, que, después de su expresión en una célula anfitriona procariótica o eucariótica, codifica un polipéptido con una actividad de fitasa, conteniendo la molécula de ADN recombinante una secuencia de ADN, que se escoge entre a) unas secuencias de ADN, que codifican un polipéptido con una actividad de fitasa, que se había obtenido mediante variación de la secuencia de la fitasa madura de E. coli de tipo silvestre, comprendiendo la variación una combinación de las mutaciones asparagina - arginina en la posición 139 (N139R) y ácido aspártico - ácido glutámico en la posición 142 (D142E) ,

b) unas secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, están emparentadas con las secuencias de acuerdo con a) ,

realizándose que la molécula de ADN recombinante, en el caso de su expresión en una adecuada célula anfitriona, va acompañada por unas estabilidades térmica y frente a proteasas aumentadas de la actividad enzimática de la proteína codificada de esta manera.

2. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la secuencia de ADN comprende adicionalmente la variación V200P del polipéptido codificado de esta manera.

3. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la secuencia de ADN comprende adicionalmente las variaciones L145I y L198I del polipéptido codificado.

4. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que como adosamiento junto al extremo terminal de N del polipéptido codificado ella comprende la secuencia FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS, y/o como adosamiento junto al extremo terminal de C del polipéptido codificado ella comprende la secuencia LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD.

5. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que ella comprende una secuencia escogida entre las secuencias SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:21.

6. Polipéptido, que posee una actividad de fitasa y que es codificado por una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 5 o que se obtiene mediante expresión de una célula anfitriona transformada con ésta.

7. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que él comprende una secuencia escogida entre las SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20 y SEQ ID NO:22.

8. Construcción artificial de ADN con la capacidad para regular la expresión de un gen de fitasa mutado en un anfitrión, después de la introducción en una célula anfitriona adecuada, caracterizada por que ella contiene una secuencia de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 5 y un terminador.

9. Construcción artificial de ADN de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada por que ella posee unas secuencias flanqueadoras en 5' y 3', un promotor y/o unas secuencias de señal y de marcador.

10. Construcción artificial de ADN de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada por que en el caso del promotor se trata del promotor de la celobiohidrolasa I, de la celobiohidrolasa II, de la amilasa, de la glucoamilasa, de la xilanasa o de la enolasa.

11. Construcción artificial de ADN de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, caracterizada por que en el caso de la secuencia de señal y/o de las secuencias flanqueadoras en 5' y 3' se trata de las secuencias de señal de la fitasa procedente de Aspergillus niger.

12. Construcción artificial de ADN de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada por que en el caso de las secuencias de señal de la fitasa procedente de Aspergillus niger se trata de las secuencias de señal modificadas de la fitasa procedente de Aspergillus niger.

13. Vector con la capacidad de transformar a una célula anfitriona, caracterizado por que él contiene una construcción artificial de acuerdo con las reivindicaciones 8 hasta 12.

14. Vector de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que él se escoge entre el conjunto formado por el plásmido pET-PhyM2, presentado bajo el número de presentación DSM 18715, el plásmido pUC-PhyM10, presentado bajo el número de presentación DSM 18719, el plásmido pPhy2005, presentado bajo el número de presentación DSM 18720, y el plásmido pPhy2006, presentado bajo el número de presentación DSM 18721.

15. Célula anfitriona transformada escogida entre hongos, levaduras, bacterias y células de mamíferos, que contiene una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 5, y que está dotada de la capacidad de expresar un polipéptido con una actividad de fitasa.

16. Célula anfitriona transformada de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada por que ella pertenece al género Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor o Penicillium.

17. Procedimiento para la producción de una fitasa, caracterizado por que se cultiva una célula anfitriona transformada de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16 en unas condiciones, que son favorables para la formación de la fitasa, y se aísla la fitasa producida de esta manera.

18. Composición, que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, eventualmente en común con otras sustancias auxiliares y/o activas.

19. Composición de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizada por que ella es una composición de alimento o pienso o un agente de panificación.

20. Utilización de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19 para la producción de un preparado destinado al mejoramiento del aprovechamiento de fosfato a partir de la nutrición en los casos de animales y seres humanos o para el mejoramiento de las propiedades reológicas de masas de panificación destinadas a la producción de productos de panificación.

21. Utilización de una variación de la secuencia de la fitasa de E. coli madura de tipo silvestre, que comprende una combinación de las mutaciones asparagina - arginina en la posición 139 (N139R) y ácido aspártico - ácido glutámico en la posición 142 (D142E) para la producción de una molécula de ADN recombinante, que, después de su expresión en una célula anfitriona procariótica o eucariótica, codifica un polipéptido con una actividad de fitasa, que posee unas estabilidades térmica y frente a proteasas aumentadas.

22. Utilización de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizada por que la utilización se efectúa en común con la variación L145I y L198I o la variación V200P, o porque la utilización se efectúa en común con la variación del adosamiento junto al extremo terminal de N de la secuencia FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS y/o la variación del adosamiento junto al extremo terminal de C de la secuencia LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD.