ANTICUERPOS MONOCLONALES, LÍNEAS DE CÉLULAS DE HIBRIDOMA, MÉTODOS Y KITS PARA DETECTAR FITASA.

Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígenos del mismo que reacciona específicamente con fitasa QUANTUM tm(Nov9X) que es producido por la línea de células de hibridoma PHY34 depositada como DSM ACC2698;

la línea de células PHY46 depositada como DSM ACC2701 o la línea de células PHYTASE Mab 28 depositada como DSM ACC2715

Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la solicitud de patente provisional de EE.UU 60/693.818, presentada el 24 de junio de 2005.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de la inmunología y, más específicamente, se refiere a anticuerpos monoclonales, métodos de inmunoensayo, incluidos ensayos ELISA y de inmunotiras, kits y reactivos, para la detección de la fitasa Quantum™ (Nov9X). La invención se refiere, además a líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales anti-fitasa Quantum™ (Nov9X), que son DSM ACC 2698, DSM ACC 2701 o DSM ACC 2715.

Antecedentes de la invención

Existe una necesidad importante de un ensayo conveniente y relativamente sencillo para detectar la presencia de fitasa en alimentos para animales. Existe también una tremenda necesidad de determinar si una planta ha sido genéticamente modificada o si el grano o alimentos procesados contienen rasgos de GMO (organismos genéticamente modificados). La necesidad requiere métodos de ensayo que puedan detectar y cuantificar el nuevo ADN o la proteína. El documento no patente de Golovan Serguei P. et al., Nature Biotechnology, 2001, 19, 741-745 describe un anticuerpo monoclonal contra fitasa de E. coli, utilizado para detectar dicho antígeno en la saliva de cerdos transgénicos utilizando técnicas de inmunocitoquímica. El documento de patente US 2005/0009116 A1 describe anticuerpos policlonales contra fitasa de E. coli que reconocen la fitasa Quantum™, pero que también reaccionan de forma cruzada con otras fitasas. La presente invención cumple esta necesidad al proporcionar anticuerpos monoclonales, líneas de células de hidriboma, métodos inmunológicos, reactivos y kits para la detección y cuantificación de fitasa Quantum™ (Nov9X).

Sumario de la invención

Se proporcionan métodos, kits y reactivos para detectar y medir la fitasa Quantum™ (Nov9X) en una muestra. La fitasa se produce en diversos microorganismos que incluyen, pero no se limitan a Escherichia coli, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris, o en plantas, que incluyen, pero no se limitan a maíz, trigo, arroz, colza y alfalfa, por ejemplo. En particular, la fitasa se detecta en los alimentos o en plantas genéticamente modificadas que contienen un gen que codifica la proteína. Los alimentos son alimentos para animales. Los alimentos para animales pueden ser para animales monogástricos o rumiantes. Los alimentos pueden ser alimentos machacados y alimentos en gránulos. Los reactivos incluyen proteína purificada y anticuerpos específicos para la fitasa Quantum™ (Nov9X). La proteína fitasa se puede aislar a partir de cuerpos de inclusión de E. coli y se puede administrar a animales para producir anticuerpos policlonales o monoclonales. Alternativamente, la proteína se puede aislar a partir de un extracto de células soluble tal como un extracto de células de E. coli.

Los anticuerpos tienen una elevada sensibilidad y especificidad por la fitasa Quantum™ (Nov9X) y son útiles en métodos de inmunoensayo para la detección de fitasa Quantum™ (Nov9X) enzimáticamente activa en animales o en organismos genéticamente modificados.

Los métodos son inmunoensayos que emplean los anticuerpos monoclonales descritos en esta memoria y son capaces de detectar bajas concentraciones de fitasa Quantum™ (Nov9X). Los anticuerpos se purifican y, por lo tanto, reaccionan mínimamente con otras proteínas que pueden estar presentes en la muestra. Los anticuerpos y/o proteínas están reunidos en un kit con reactivos de inmunoensayo convencionales para la detección de la fitasa Quantum™ (Nov9X).

A la vista de lo anterior, existe una necesidad real del desarrollo de tecnología que permita la identificación de fitasa Quantum™ (Nov9X) en muestras.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una gráfica que muestra una curva patrón para la actividad de fitasa.

La Figura 2 es una gráfica que muestra el porcentaje de actividad relativa frente al tiempo de incubación a 99ºC de la enzima fitasa tanto en un ensayo ELISA como en un ensayo de actividad enzimática. La detección de la enzima fitasa en el ELISA es análoga a la cantidad de actividad detectada en el ensayo de actividad enzimática.

La Figura 3 es una reproducción escaneada de tests de inmunotiras que muestran la detección de fitasa (flecha) después de incubación a 99ºC hasta durante una hora. Después de aproximadamente 20 minutos a 99ºC se observa una disminución en la detección de fitasa.

La Figura 4 es una descripción de un kit de test de inmunoensayo a modo de ejemplo y el método de utilizar el mismo.

Las Figuras 5A-C, son una serie de tres inmunotiras que muestran una comparación del revestimiento de anticuerpos monoclonales anti-fitasa y su capacidad para detectar fitasa de muestras de ensayo de alimentos en grano que contienen fitasa a concentraciones de 0 U/kg; 250 U/kg; o 500 U/kg. La Figura 5A muestra las tres inmunotiras con nitrocelulosa, revestidas con anticuerpos PHY46 monoclonales en calidad del anticuerpo de revestimiento; la Figura 5B muestra los tres inmunotiras con nitrocelulosa, revestidas con PHY36 monoclonal en calidad del anticuerpo de revestimiento y la Figura 5C muestra las inmunotiras con nitrocelulosa, revestidas con PHY37 monoclonal en calidad del anticuerpo de revestimiento. Para la detección de todas las inmunotiras se utilizó PHY34 monoclonal conjugado con oro.

La Figura 6 es una comparación de ensayos de inmunotira de fitasa utilizando anticuerpos anti-fitasa monoclonales (fila superior) o anticuerpos anti-fitasa policlonales (fila inferior). Muestras de enzima fitasa en las pistas de muestra eran: pista 9 - Ronozyme®; pista 10 - Phyzyme®; pista 11 - Natuphos®; y pista 12 - fitasa Quantum™.

La Figura 7 es una curva patrón de fitasa presente en muestras testadas utilizando un ELISA de anticuerpos monoclonales.

Las Figuras 8A-K muestran las etapas para el ELISA de fitasa Quick Quantum™. Figura 8A - moler 300 g de alimentos en un molinillo de café; 8B – añadir 80 ml de tampón de extracción a 20 g de muestra; 8C – agitar vigorosamente durante 1 minuto; 8D – dejar reposar el recipiente durante 30 minutos; 8E – montar la placa y los reactivos y llevar hasta temperatura ambiente; 8F – añadir 50 μl de controles o muestras a los pocillos; 8G – añadir 50 μl del conjugado a los pocillos e incubar durante 30 minutos; 8H – lavar los pocillos 5 veces con agua destilada; 8I – añadir 100 μl de sustrato a los pocillos e incubar durante 15 minutos; 8J – interpretar los resultados visualmente o leerlos a 650 nm en un lector de placas, y 8K – muestra los resultados representativos.

Descripción detallada de las realizaciones descritas

En esta memoria se describen métodos, kits y reactivos para la detección de fitasa Quantum™ (Nov9X) en una muestra. También se describen líneas de células monoclonales que producen anticuerpos monoclonales antifitasa.

La metodología de la invención se puede utilizar para detectar cualquier enzima en muestras tales como alimentos para animales. Se conoce un cierto número de fitasas.

Fitasas conocidas incluyen, pero no se limitan a las descritas en el documento WO 01/90333, titulado “Recombinant Bacterial Phytases and Uses Thereof”; documento WO 99/08539 titulado, “Novel Phytase”; publicación de solicitud de EE.UU. nº 20030157646, titulada “Microbially Expressed Thermotolerant Phytase For Animal Feed”, y publicación de solicitud de EE.UU. nº 20030170293, titulada “Termotolerant Phytase for Animal Feed”. Cuando se realizan inmunoensayos para detectar fitasa Quantum™ (Nov9X) en plantas transgénicas y en los productos producidos a partir de ellas (incluidas fracciones de alimentos), es importante que un ensayo tenga la

capacidad de detectar la proteína específica. Así, son muy importantes anticuerpos muy específicos para el

desarrollo de productos comerciales de éxito.

Los reactivos son fitasa Quantum™ (Nov9X) antigénica y anticuerpos anti-fitasa Quantum™ (Nov9X) que son muy específicos para la fitasa Quantum™ (Nov9X). El método es un inmunoensayo para la detección sensible y específica de fitasa Quantum™ (Nov9X) específicamente para... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígenos del mismo que reacciona específicamente con fitasa QUANTUM™ (Nov9X) que es producido por la línea de células de hibridoma PHY34 depositada como DSM ACC2698; la línea de células PHY46 depositada como DSM ACC2701 o la línea de células PHYTASE Mab 28 depositada como DSM ACC2715.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo de la reivindicación 1, que ha sido marcado.

3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo de la reivindicación 2, que ha sido marcado con biotina, peroxidasa, fosfatasa alcalina, glucoamilasa o beta-galactosidasa.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo de la reivindicación 3, que ha sido marcado con 125I,131I o tritio

5. Un soporte sólido, al que se ha fijado el anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo de la reivindicación 1.

6. Una composición que comprende el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígenos del mismo de la reivindicación 1 y un tampón o diluyente.

7. Una línea de células de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígenos del mismo de la reivindicación 1.

8. La línea de células de hibridoma de la reivindicación 7, en donde la línea de células es la línea de células PHY34 depositada como DSM ACC2698; la línea de células PHY46 depositada como DSM ACC2701 o la línea de células PHYTASE Mab 28 depositada como DSM ACC2715.

9. Un inmunoensayo para la fitasa QUANTUM™ (Nov9X), que comprende:

a) poner en contacto el anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígenos del mismo de la reivindicación 1 con una muestra de la que se sospecha que contiene la fitasa, durante un tiempo y bajo condiciones adecuadas para unir el anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo a la fitasa,

b) determinar la unión entre el anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo y fitasa, y

c) relacionar la unión a la presencia o cantidad de la fitasa en la muestra.

10. El inmunoensayo de la reivindicación 9, que es un RIA o que es un EIA.

11. Un inmunoensayo para la detección de fitasa QUANTUM™ (Nov9X) en una muestra, que comprende las etapas de:

a) preparar un extracto de la muestra en presencia de un anticuerpo monoclonal primario o fragmento de unión a antígenos de la reivindicación 1 que reconoce inmunológicamente la fitasa en el extracto, de modo que se forma un complejo de anticuerpo primario-fitasa;

b) preparar un formato en fase sólida que tiene una medición en tres dimensiones para formar un volumen con una pluralidad de espacios intersticiales, al unir al formato en fase sólida un anticuerpo secundario deseado o fragmento capaz de reconocer inmunológicamente la fitasa, y en donde el anticuerpo secundario está conjugado a medios de detección, y en donde el anticuerpo secundario reconoce también inmunológicamente la fitasa;

c) combinar el extracto de la etapa (a) con el formato preparado de la etapa (b), en donde el extracto se extrae a través de los espacios intersticiales del formato en fase sólida preparado capturando el complejo anticuerpo primario-fitasa;

d) detectar la fitasa por la presencia de dicho complejo anticuerpo primario-fitasa capturado.

12. El inmunoensayo de la reivindicación 11, en el que el formato en fase sólida es acetato de celulosa, celulosa,

nitrocelulosa o nilón. 13. El inmunoensayo de la reivindicación 12, en el que el formato en fase sólida está constituido por múltiples capas apiladas y contiguas, en donde cada una de las capas es capaz de capturar una fitasa diferente.

14. El inmunoensayo de la reivindicación 13, que comprende, además, una almohadilla de absorción de muestras

del formato en fase sólida. 15. El inmunoensayo de la reivindicación 14, que comprende, además, una tira que comprende un anticuerpo antifitasa marcado.

16. El inmunoensayo de la reivindicación 15, en el que los medios de detección son oro coloidal. 17. Un kit para la detección, mediante el inmunoensayo de la reivindicación 14, que comprende: a) medios de extracción de la fitasa a partir de una muestra; y b) un formato en fase sólida que comprende un anticuerpo monoclonal primario anti-fitasa o un fragmento de unión

a antígeno del mismo de la reivindicación 1 y que tiene una medición en tres dimensiones para formar un volumen con una pluralidad de espacios intersticiales, al unir al formato en fase sólida un anticuerpo secundario deseado o un fragmento capaz de reconocer inmunólogicamente a la fitasa, y en donde el anticuerpo secundario está conjugado a medios de detección, y en donde el anticuerpo secundario reconoce también inmunológicamente a la fitasa.

18. El kit de la reivindicación 17, que comprende, además, un recipiente que contiene un tampón.

19. El kit de la reivindicación 18, que comprende, además, medios para dispensar la muestra sobre el formato en fase sólida. 20. Un inmunoensayo para la detección y cuantificación de fitasa QUANTUM™ (Nov9X), que comprende las

etapas de: a) preparar un extracto de una muestra; b) incubar una porción del extracto con un anticuerpo monoclonal anti – fitasa primario o un fragmente de unión a

antígenos del mismo de la reivindicación 1 que se une a la fitasa, estando unido el anticuerpo primario a un soporte sólido, y un anticuerpo anti – fitasa secundario o fragmento que se une a la fitasa para crear un complejo anticuerpo – fitasa – anticuerpo,

c) lavar un complejo anticuerpo–fitasa–anticuerpo para separar el anticuerpo secundario no unido;

d) añadir un anticuerpo de detección que reacciona inmunológicamente con el anticuerpo secundario, en donde el anticuerpo de detección está marcado; y e) medir la cantidad de anticuerpo marcado unido o no unido para determinar la concentración de fitasa. 21. El inmunoensayo de la reivindicación 20, en el que el marcador detectable es una enzima. 22. El inmunoensayo de la reivindicación 21, en el que la enzima es fosfatasa alcalina, peroxidasa o β

galactosidasa. 23. El inmunoensayo de la reivindicación 22, en el que la enzima produce un producto de reacción insoluble.

24. Un kit para la detección y cuantificación por parte del inmunoensayo de la reivindicación 20, que comprende: a) medios para extraer la fitasa QUANTUM™ de una muestra; b) un soporte sólido que comprende un anticuerpo anti-fitasa primario de la reivindicación 1, unido al soporte sólido; c) un anticuerpo anti-fitasa secundario; y

10 d) un anticuerpo de detección capaz de unirse inmunológicamente al anticuerpo secundario, y en donde el anticuerpo de detección está marcado con un marcador detectable. 25. El kit de la reivindicación 24, en donde el marcador detectable es una enzima. 15 26. El kit de la reivindicación 25, en donde la enzima de detección es fosfatasa alcalina, peroxidasa o βgalactosidasa. 27. El kit de la reivindicación 26, en donde la enzima produce un producto de reacción soluble o insoluble. 20 28. El kit de la reivindicación 27, que comprende, además un sustrato para la enzima