PÉPTIDO INMUNOGÉNICO DEL GLUTEN Y SUS APLICACIONES.

Péptido inmunogénico del gluten y sus aplicaciones.

La presente invención proporciona un péptido inmunogénico de ocho aminoácidos que se genera de forma natural en el intestino de los pacientes celiacos por la hidrólisis del gluten ingerido.

Por tanto, la invención se refiere al uso de dicho péptido, o de anticuerpos generados frente al mismo, para el diagnóstico y/o seguimiento in vitro de la enfermedad celiaca, así como al uso de tales anticuerpos para la detección de gluten en alimentos. Son también objeto de la presente invención el uso del péptido mencionado como diana terapéutica para el desarrollo de compuestos o composiciones útiles para el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de esta condición patológica, así como el uso de este péptido y de los anticuerpos frente al mismo para la prevención y/o tratamiento de la enfermedad celiaca.

Péptido inmunogénico del gluten y sus aplicaciones

La presente invención se encuadra en el campo de la salud y de la alimentación, específicamente dentro de los péptidos inmunogénicos del gluten útiles para el diagnóstico, seguimiento y/o tratamiento terapéutico de la enfermedad celiaca en individuos, así como para la detección de gluten en alimentos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La enfermedad celiaca es una enteropatía inducida por gliadina (prolamina del trigo) y otras prolaminas de cereales relacionados como secalina (centeno) , hordeína (cebada) y algunos tipos de aveninas (avena) en individuos predispuestos genéticamente (HLA-DQ2/DQ8) .

Actualmente, la inmunopatogénesis de la enfermedad celiaca se explica mediante un modelo que contempla dos señales diferentes. Por un lado, algunos péptidos de la gliadina que se generarían durante la digestión gastrointestinal, como el 19-mer, juegan un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad celiaca al desencadenar una respuesta inmunológica innata (Jabri B. and Sollid LD., 2006, Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol.; 3 (9) :516-525) a través de mecanismos independientes de DQ2 que dan lugar a la producción de IL-15 en células epiteliales. El resultado es la interrupción de la barrera epitelial y la inducción de la apoptosis en los enterocitos. Por otro lado, otros péptidos inmunodominantes, como el 33-mer (Shan L., et al., 2002, Science; 297 (5590) :2275-2279) , transforman en glutamato algunos de sus residuos de glutamina (desaminación) por la acción de la transglutaminasa tisular (tTG) y pueden llegar a la lámina propia donde son presentados por células dendríticas a ciertos linfocitos T específicos restringidos a moléculas HLA-DQ2/DQ8. La inflamación que se produce a continuación se ajusta a un perfil de citoquinas tipo I, mediada por IFNγ, y la lesión se caracteriza por una infiltración masiva de linfocitos intraepiteliales, hiperplasia críptica y atrofia de las vellosidades.

Hoy en día, el único tratamiento para la enfermedad celiaca consiste en mantener de por vida una dieta libre de gluten, la cual suele conducir a la completa remisión de la enfermedad. Dicho tratamiento es bien tolerado por los pacientes celiacos y supone una clara mejora en su salud y calidad de vida. Sin embargo, mantener de manera rigurosa una dieta exenta de gluten resulta muy difícil debido, por ejemplo, a la presencia de trazas contaminantes en los alimentos sin gluten, su alto precio o la presión social a la que se ven sometidos estos pacientes, sobre todo los más jóvenes, para consumir gluten y que está ocasionada por las costumbres alimenticias imperantes en Occidente. Por todas estas razones, durante los últimos años se han investigado terapias alternativas a la dieta libre de gluten que tratan de combatir la enfermedad por distintas vías: disminuyendo la exposición al gluten (por ejemplo, mediante la degradación enzimática de las fracciones tóxicas de los cereales) , inhibiendo la permeabilidad intestinal o modulando la respuesta inmunitaria (por ejemplo, mediante el desarrollo de vacunas basadas en péptidos del gluten, o la inhibición de la tTG) .

La anulación de la actividad tóxica e inmunogénica del gluten mediante degradación enzimática presenta muchos atractivos como terapia oral alternativa. En este sentido, se ha probado la actividad detoxificadora de distintas enzimas como la prolil endopeptidasa o una endoproteasa específica de glutamina. Otra fuente enzimática para la hidrólisis del gluten son las bacterias probióticas. No obstante, es indudable que el éxito de este tipo de terapias está vinculado a una mejor y más completa caracterización de los péptidos que componen la fracción tóxica del gluten.

Otro aspecto de la enfermedad celíaca que está en desarrollo es el del diagnóstico. Actualmente, la única prueba admitida por la comunidad médica para diagnosticar definitivamente a un enfermo celiaco es el análisis histopatológico de biopsias de intestino delgado, las cuales deben mostrar las típicas anomalías morfológicas. No obstante, se han desarrollado diversas pruebas serológicas que, al ser menos agresivas que la biopsia, están indicadas como paso previo en el diagnóstico de la enfermedad. La prueba serológica más sensible y específica es la detección de autoanticuerpos tipo IgA contra el endomisio (EMA) o contra la tTG. El desarrollo de pruebas para detectar la presencia de anticuerpos contra péptidos tóxicos del gluten desaminados se ha demostrado también como herramienta muy útil en el diagnóstico de la enfermedad (Tack GJ., et al., 2010, Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology; 7:204-213) .

Para avanzar en el desarrollo de un mejor diagnóstico y tratamiento de la enfermedad celiaca es fundamental el estudio de su patogénesis, en la cual interaccionan de manera muy compleja factores de carácter ambiental, genético e inmunológico. Los determinantes ambientales fundamentales para el desarrollo de la enfermedad son de tipo alimenticio: el gluten del trigo y otras proteínas relacionadas inducen respuestas inmunitarias de tipo innato y adaptativo que provocan el daño en la mucosa del intestino delgado. El gluten comprende un conjunto de más de 100 proteínas de reserva que se encuentran en la semilla del trigo. Según su nivel de solubilidad, el gluten se divide en gliadinas y gluteninas, ambas implicadas en la enfermedad celiaca. Existen homólogos de estas proteínas en la cebada, el centeno y algunas variedades de avena, lo que explica que dichos cereales puedan también provocar la enfermedad. Se ha propuesto que hay péptidos procedentes del gluten, y proteínas relacionadas de la cebada, el centeno y la avena, que no son completamente digeridos por las enzimas gastrointestinales y pancreáticas, lo que provoca que, bajo ciertas condiciones, puedan penetrar en la lámina propia del intestino delgado. Además, se ha especulado que ciertos factores estresantes, como infecciones de tipo vírico, pueden afectar a la permeabilidad intestinal favoreciendo la aparición de la enfermedad celiaca.

Los péptidos del gluten resistentes a la digestión son ricos en prolina y glutamina, puesto que la mayoría de las proteasas no cortan en residuos adyacentes a la prolina, y la glutamina no es un residuo preferente para ninguna de las endoproteasas del intestino. Por tanto, los péptidos con longitud suficiente como para desencadenar una respuesta inmunitaria son capaces de evadir la digestión gastrointestinal y llegar intactos al epitelio. Tal es el caso del péptido 33-mer de la α-gliadina de trigo, que es resistente a proteasas y que se ha considerado como el iniciador primario de la respuesta inflamatoria al gluten en los enfermos celiacos. Así, se ha demostrado mediante ensayos in vitro que el péptido 33-mer es el péptido del gluten más bioactivo (inmunodominante) que es reconocido por células T procedentes de donantes celiacos HLA-DQ2+, aunque no es el único péptido que muestra tal actividad.

La identificación de los péptidos del gluten desencadenantes de respuesta en las células T intestinales es crucial, entre otras cosas, para la búsqueda de terapias alternativas a la dieta exenta de gluten. La bibliografía recoge algunos péptidos del gluten con actividad inmunotóxica demostrada (Tye-Din J., et al., 2010, Science Translational Medicine; 2 (41) :1-14; Camarca A., et al., 2009, The Journal of Immunology; 189:4158-4166; Vader, et al., 2002, Gastroenterology; 122:1729–1737) , la mayoría de los cuales pertenecen a las familias α o γ−gliadinas, seguido por las gluteninas y con menor frecuencia a la ω-gliadina. Los péptidos tóxicos del gluten son de aplicación en métodos de diagnóstico y/o tratamiento de los individuos celiacos (WO03066079, EP0905518, US5817523, WO9727217, US20080318852, US20090156490 y US20060240475) .

Otra aplicación derivada de la identificación de un péptido del gluten con actividad inmunotóxica consiste en la medición de la fracción tóxica del gluten en alimentos. Las técnicas más implantadas para el control del gluten en los alimentos son los ensayos ELISA, la técnica de PCR, Western Blot, espectrometría de masas, cromatografía y tiras inmunocromatográficas. Entre ellas, son las técnicas enzimáticas inmunoabsorbentes (ELISA) , basadas en anticuerpos monoclonales frente a epitopos específicos, las que reúnen las características más deseables de sencillez, sensibilidad y economía. Más novedosas, y aún en desarrollo, son las técnicas que utilizan biosensores o tecnología de labon-a-chip.

Para la detección de gluten mediante ELISA se han desarrollado distintos anticuerpos que reconocen diferentes epitopos del gluten. Se ha descrito que no solamente los péptidos de... [Seguir leyendo]

1. Péptido aislado de secuencia SEQ ID NO: 1.

2. Péptido según la reivindicación 1 donde la secuencia es SEQ ID NO:

2.

3. Péptido según la reivindicación 1 donde la secuencia es SEQ ID NO:

3.

4. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que además presenta un compuesto químico unido a su extremo N- y/o C- terminal.

5. Péptido según la reivindicación 4 donde el compuesto químico es un compuesto cromogénico, fluorigénico o luminiscente.

6. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que además presenta otro péptido unido a su extremo N- y/o C-terminal.

7. Secuencia nucleotídica aislada que codifica para el péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Anticuerpo frente al péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. Célula que expresa el anticuerpo según la reivindicación 8.

10. Composición que comprende el péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la secuencia nucleotídica según la reivindicación 7, el anticuerpo según la reivindicación 8 o la célula según la reivindicación 9.

11. Uso del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de la secuencia nucleotídica según la reivindicación 7 para la identificación

o diseño de compuestos o composiciones para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de la enfermedad celiaca.

12. Uso del anticuerpo según la reivindicación 8 o de la célula según la reivindicación 9 para la detección y/o cuantificación del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

13. Uso del anticuerpo o de la célula según la reivindicación 12 donde la detección y/o cuantificación del péptido se realiza en alimentos.

14. Uso del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, del anticuerpo según la reivindicación 8 o de la célula según la reivindicación 9 para el diagnóstico y/o seguimiento in vitro de la enfermedad celiaca en un individuo.

15. Uso del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, de la secuencia nucleotídica según la reivindicación 7, del anticuerpo según la reivindicación 8, de la célula según la reivindicación 9 o de la composición según la reivindicación 10, para la elaboración de un medicamento.

16. Uso del péptido, de la secuencia nucleotídica, del anticuerpo, de la célula o de la composición según la reivindicación 15, donde el medicamento es para la prevención y/o tratamiento de la enfermedad celiaca.

17. Uso del péptido, de la secuencia nucleotídica, del anticuerpo, de la célula o de la composición según la reivindicación 16, donde el medicamento es una vacuna.

18. Kit que comprende el péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

19. Kit que comprende el anticuerpo según la reivindicación 8.

20. Uso del kit según la reivindicación 19 para la detección y/o cuantificación del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a

3.

21. Uso del kit según la reivindicación 20 donde la detección y/o cuantificación del péptido se realiza en alimentos.

22. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19 para el

diagnóstico y/o seguimiento in vitro de la enfermedad celiaca en un 15 individuo.

FIG. 1

a)

b)

basal LPS 8-mer 19-me.

3. mer

basal LPS 8-mer 19-me.

3. mer

basal LPS 8-mer 19-me.

3. mer basal LPS 8-mer 19-me.

3. mer

FIG. 2 (cont.)

ES 2 402 286 Al

basal LPS 8-mer 19-me.

3. mer

basal LPS 8-mer 19-me.

3. mer

basal LPS 8-mer 19-me.

3. mer

FIG. 3

basal LPS 8-mer 19-me.

3. mer

basal LPS 8-mer 19-me.

3. mer

basal LPS 8-mer 19-me.

3. mer

FIG. 3 (cont.)

basal LPS 8-mer 19-me.

3. mer

0.08

0.07

0.06

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

0.00

basal LPS 8-mer 19-me.

3. mer

basal LPS 8-mer 19-me.

3. mer

FIG. 3 (cont.)

8mer 100 g/ml 8mer 10 g/ml 8mer 1 g/ml 19mer 100 g/ml 33mer 100 g/ml

Péptido SEQ ID NO: 6-BIOTINA (desaminado)

CELIACOS CONTROLES

Péptido SEQ ID NO: 7-BIOTINA (nativo)

CELIACOS CONTROLES

FIG. 5

***

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***

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FIG. 6

EIIºººººº EIIººººººº EIIºººAººººº ººº

FIG. 7