Obtención de perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados.

Método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mamasin la recidiva de cáncer de mama,

tras la extirpación quirúrgica del tumor primario, que comprende

determinar el nivel del transcrito de ARN de BAG1 en una muestra de tejido de cáncer de mama obtenidade dicho paciente, normalizado frente al nivel de expresión de todos los transcritos de ARN sometidos aensayo en dicha muestra, o un conjunto de referencia de transcritos de ARN,

en el que un aumento del nivel normalizado del transcrito de ARN de BAG1 en comparación con el nivelnormalizado del transcrito de ARN de BAG1 en un conjunto de referencia de tejidos de cáncer de mamaindica un aumento de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama.

Obtención de perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados

Campo de la invención La presente invención se refiere a la obtención del perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados. En particular, la presente invención se refiere a métodos sensibles para medir los niveles de ARNm en tejidos tumorales biopsiados, incluyendo material de biopsia incrustado en parafina archivado. Además, la invención proporciona un conjunto de genes cuya expresión es importante en el diagnóstico y tratamiento del cáncer de mama.

Los oncólogos disponen de varias opciones de tratamiento, incluyendo diferentes combinaciones de fármacos quimioterápicos que se caracterizan como “tratamiento de referencia”, y varios fármacos que no portan un declarado en la etiqueta para un cáncer particular, pero para los que hay pruebas de eficacia en ese cáncer. La mejor

probabilidad de un buen desenlace del tratamiento requiere que los pacientes se asignen al tratamiento contra el cáncer disponible óptimo, y que esta asignación se haga lo más rápidamente como sea posible tras el diagnóstico.

Actualmente, las pruebas de diagnóstico usadas en la práctica clínica son de analito único, y por tanto no capturan el valor potencial de conocer las relaciones entre docenas de diferentes marcadores. Además, las pruebas de diagnóstico frecuentemente son no cuantitativas, basándose en inmunohistoquímica. Este método produce a menudo diferentes resultados en diferentes laboratorios, en parte porque los reactivos no están normalizados, y en parte porque las interpretaciones son subjetivas y no pueden cuantificarse fácilmente. Las pruebas basadas en ARN no se han usado a menudo debido al problema de la degradación del ARN a lo largo del tiempo y el hecho de que es difícil obtener muestras de tejido recientes de los pacientes para el análisis. Está más fácilmente disponible tejido incrustado en parafina fijado y se han establecido métodos para detectar ARN en tejido fijado. Sin embargo, estos métodos normalmente no permiten el estudio de grandes números de genes (ADN o ARN) a partir de pequeñas cantidades de material. Por tanto, pocas veces se ha usado tejido fijado de manera tradicional para otras cosas que para la detección inmunohistoquímica de proteínas.

Recientemente, varios grupos han publicado estudios referentes a la clasificación de diversos tipos de cáncer mediante análisis de la expresión génica con microalineamientos (véanse, por ejemplo Golub et al., Science 286:531-537 (1999) ; Bhattacharjae et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:13790-13795 (2001) ; Chen-Hsiang et al., Bioinformatics 17 (supl. 1) :S316-S322 (2001) ; Ramaswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:15149-15154 (2001) ) . También se han notificado ciertas clasificaciones de cánceres de mama humanos basándose en los patrones de expresión génica (Martin et al., Cancer Res. 60:2232-2238 (2000) ; West et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:11462-11467 (2001) ; Sorlie et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:10869-10874 (2001) ; Yan et al., Cancer Res. 61:8375-8380 (2001) ) . Sin embargo, estos estudios se centran en su mayor parte en mejorar y refinar la clasificación ya establecida de diversos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, y generalmente no proporcionan nuevas percepciones en las relaciones de los genes expresados de manera diferencial, y no vinculan los hallazgos a estrategias de tratamiento con el fin de mejorar el desenlace clínico de la terapia contra el cáncer.

Aunque la moderna bioquímica y biología molecular han revelado más de 100 genes cuyas actividades influyen en el comportamiento de células tumorales, el estado de su diferenciación y su sensibilidad o resistencia a ciertos fármacos terapéuticos, con unas pocas excepciones, el estado de estos genes no se ha aprovechado para el fin de 45 tomar decisiones clínicas de manera rutinaria sobre los tratamientos farmacológicos. Una notable excepción es el uso de la expresión de la proteína de receptor de estrógenos (RE) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes a tratamiento con fármacos antiestrógenos, tales como tamoxifeno. Otro ejemplo excepcional es el uso de la expresión de la proteína ErbB2 (Her2) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes con el fármaco antagonista de Her2 Herceptin® (Genentech, Inc., South San Francisco, CA) .

A pesar de los recientes avances, el desafío del tratamiento contra el cáncer sigue siendo dirigir regímenes de tratamiento específicos a tipos de tumores patogénicamente distintos, y en última instancia personalizar el tratamiento tumoral con el fin de maximizar el desenlace. Por tanto, existe una necesidad de pruebas que proporcionan simultáneamente información predictiva sobre las respuestas de los pacientes a la variedad de 55 opciones de tratamiento. Esto es particularmente cierto para cáncer de mama, cuya biología se entiende mal. Está claro que la clasificación del cáncer de mama en unos cuantos subgrupos, tales como el subgrupo ErbB2+ y los subgrupos caracterizados por expresión génica de baja a ausente del receptor de estrógenos (RE) y unos cuantos factores de transcripción adicionales (Perou et al., Nature 406:747-752 (2000) ) no se refleja en la heterogeneidad celular y molecular del cáncer de mama, y no permite el diseño de estrategias de tratamiento que maximicen la respuesta del paciente El documento WO 01/04343 A2 (BURNHAM INST [EE.UU.]; REED JOHN C [EE.UU.] cita un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de cáncer de mama sin recidiva basado en la determinación del nivel de expresión de ARNm de BAG1 (véase la reivindicación 6) pero el documento no proporciona ningún ejemplo 65 práctico de tal método ni ninguna evidencia experimental de correlación entre dichos niveles de ARNm y el pronóstico del cáncer de mama.

TOWNSEND ET AL (JOURNAL OF PATHOLOGY, vol. 17, n.º 1, págs. 51-59, 2002) dan a conocer que no existe ninguna correlación entre los niveles de expresión de la proteína BAG1 y de expresión de ARN.

Sumario de la invención

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin recidiva de cáncer de mama, tras la extirpación quirúrgica del tumor primario tal como se especifica en la reivindicación 1.

La presente invención adapta el uso de material de biopsia incrustado en parafina archivado para el ensayo de todos los marcadores en el conjunto, y por tanto es compatible con el tipo de material de biopsia más ampliamente disponible.

En una realización particular, se determina el nivel de expresión de uno o más transcritos de ARN de pronóstico, en el que puede obtenerse ARN, por ejemplo, a partir de una muestra de tejido de cáncer de mama incrustado en cera, fijado del paciente. El aislamiento del ARN puede llevarse a cabo, por ejemplo, siguiendo cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente o a lo largo de la solicitud, o mediante cualquier otro método conocido en la técnica.

Puede cuantificarse el nivel de transcrito de ARN de BAG1 mediante RT-PCR.

Puede cuantificarse el nivel de expresión del transcrito de ARN de BAG1, o su producto de expresión, mediante alineamiento. 25

Breve descripción de los dibujos La figura 1 es un gráfico que ilustra el flujo de trabajo del procedimiento de la invención para la medición de la expresión génica. En la figura, FPET significa “tejido incrustado en parafina fijado” y “RT-PCR” significa “PCR con 30 transcriptasa inversa”. Se determina la concentración de ARN usando el protocolo y reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ comercial.

La figura 2 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un método de extracción de ARN según la invención junto a un diagrama de flujo de un método comercial representativo.

La figura 3 es un esquema que ilustra las etapas de un método mejorado para preparar ARNm fragmentado para el análisis de obtención del perfil de expresión.

La figura 4 ilustra métodos para la amplificación de ARN antes de la RT-PCR. 40 La figura 5 ilustra un esquema alternativo para la reparación y amplificación de ARNm fragmentado.

La figura 6 muestra la medición de los niveles de ARNm del receptor de estrógenos en 40 muestras de cáncer de mama FPE mediante RT-PCR. Se usaron tres secciones de 10 micrómetros para cada medición. Cada punto de 45 datos representa el promedio de mediciones por triplicado.

La figura 7 muestra los resultados de la medición de los niveles de ARNm del receptor de progesterona en 40 muestras de cáncer de mama FPE mediante RT-PCR realizada... [Seguir leyendo]

1. Método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin la recidiva de cáncer de mama, tras la extirpación quirúrgica del tumor primario, que comprende

determinar el nivel del transcrito de ARN de BAG1 en una muestra de tejido de cáncer de mama obtenida de dicho paciente, normalizado frente al nivel de expresión de todos los transcritos de ARN sometidos a ensayo en dicha muestra, o un conjunto de referencia de transcritos de ARN,

en el que un aumento del nivel normalizado del transcrito de ARN de BAG1 en comparación con el nivel normalizado del transcrito de ARN de BAG1 en un conjunto de referencia de tejidos de cáncer de mama indica un aumento de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el cáncer de mama es cáncer de mama invasivo. 15

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho ARN se aísla de una muestra de tejido de cáncer de mama incrustado en cera, fijado de dicho paciente.

4. Método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el nivel del transcrito de ARN de BAG1 se cuantifica 20 mediante RT-PCR.

5. Método la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el nivel del transcrito de ARN de BAG1 se cuantifica mediante un alineamiento.