Nuevos polipéptidos con afinidad por HER2.

Un polipéptido de unión a HER2 que comprende la secuencia de aminoácidos EX1RNAYWEIA LLPNLTNQQK RAFIRKLYDD PSQSSELLX2E AKKLNDSQ en la que X1 de la posición 2 es M,

I ó L, y X2 de la posición 39 es S ó C (SEQ ID NO: 1).

Nuevos polipéptidos con afinidad por HER2

Campo de la invención La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos que se unen a Receptor 2 de Factor de Crecimiento Epidérmico Humano (a partir de aquí referido como HER2, del inglés “Human Epidermal Growth Factor Receptor 2”) .

La presente invención también se refiere al uso de dicho polipéptido de unión a HER2 como agente diagnóstico y/o como medicamento, más particularmente a su uso como agente diagnóstico y/o como medicamento para la diagnosis y/o para el tratamiento de formas de cáncer que se caracterizan por la sobre-expresión de HER2.

Antecedentes HER2 y su función en enfermedades de cáncer

El proto-oncogén de HER2 codifica la producción de una proteína receptora de superficie celular de 185 kDa conocida como proteína o receptor HER2 (Hynes NE et al. (1994) Biochem Biophys Acta 1198: 165-184) . Este gen también se denomina a veces neu, HER2/neu ó c-erbB-2. El neu se descubrió por primera vez en ratas que habían sido tratados con etilnitrosourea, y presentaban una mutación en este gen (Shih C et al. (1981) Nature 290: 261264) . La versión mutada de neu da como resultado la producción de una forma constitutivamente activa del receptor, y constituye un potente oncogén que puede transformar células con un bajo número de copia (Hynes NE et al., ver anterior) .

Las células normales expresan una pequeña cantidad de proteína HER2 sobre sus membranas plasmáticas en una estructura específica de tejido. No se ha determinado ningún ligando conocido de HER2; sin embargo, se ha demostrado que HER2 forma heterodímeros con HER1 (el receptor de factor de crecimiento epidérmico, EGFR, del

inglés “epidermal growth factor receptor”) , HER3 y HER4 en complejo con los ligandos de estos receptores. Dicha formación de heterodímero conduce a que el receptor HER2 activado transmita señales de crecimiento desde el exterior de la célula hasta el núcleo, controlando de este modo aspectos de crecimiento y división celular normales (Sundaresan S et al. (1999) Curr Oncol Rep 1: 16-22) .

En células tumorales, los errores en el sistema de replicación de ADN pueden dar como resultado la existencia de múltiples copias de un gen en un único cromosoma, lo que es un fenómeno conocido como amplificación génica. La amplificación del gen de HER2 conduce a un aumento de la transcripción de dicho gen. Esto eleva los niveles de ARNm de HER2 y aumenta la síntesis concomitante de proteína HER2, lo que da como resultado la sobre-expresión de proteína HER2 sobre la superficie de dichas células tumorales. Esta sobre-expresión puede dar como resultado niveles de proteína HER2 que son entre 10 y 100 veces superiores a los observados en las células adyacentes normales. Esto a su vez produce un aumento de la división celular y una mayor tasa concomitante de crecimiento celular. La amplificación del gen de HER2 está implicada en la transformación de células normales en el fenotipo de cáncer (Hynes NE et al, ver anterior; Sundaresan S et al, ver anterior) .

Se cree que la sobreexpresión de proteína HER2 da como resultado la formación de homodímeros de HER2, lo que a su vez produce un receptor constitutivamente activa (Sliwkowski MX et al. (1999) Semin Oncol 26 (4, Supl. 12) : 6070) . En estas condiciones, las señales promotoras de crecimiento pueden transmitirse continuamente en las células en ausencia de ligandos. Consecuentemente, se activan múltiples mecanismos de transducción de señal intracelular, lo que da como resultado un crecimiento celular no regulado y en algunos casos una transformación oncogénica (Hynes NE et al, ver anterior) . Por tanto, los mecanismos de transducción de señal mediados por receptores de factor de crecimiento son importantes dianas para inhibir la replicación celular y el crecimiento tumoral.

El cáncer de mama es la malignidad más común entre las mujeres en los Estados Unidos, con 192200 nuevos casos estimados en 2001 (Greenlee R et al. (2001) CA Cancer J Clin 51: 15-36) . En aproximadamente el 25 % de todos los pacientes de cáncer de mama existe una sobreexpresión del gen de HER2 debido a su amplificación (Slamon DJ et al. (1989) Science 244: 707-712) . Esta sobreexpresión de proteína de HER2 se correlaciona con varias variables prognósticas negativas, que incluyen estatus negativo de receptor de estrógeno, alta fracción de fase-S, estatus nodal positivo, p53 mutado y elevado grado nuclear (Sjogren S et al. (1998) J Clin Oncol 16 (2) : 462-469) . Según Slamon et al. (ver anterior) , se observó que la amplificación del gen de HER2 se correlaciona estrechamente con una supervivencia libre de enfermedad más corta y una supervivencia general más corta de pacientes de nodos positivos.

Por estas razones, un objetivo importante ha sido, y sigue siendo, llevar a cabo investigaciones sobre la función del HER2 en la patogénesis y el tratamiento del cáncer de mama. La identificación de moléculas que interactúan con HER2 constituye una parte de este esfuerzo.

Estudios in vitro preclínicos han examinado si la inhibición de la actividad de HER2 podría afectar al crecimiento de células tumorales. El tratamiento de células de cáncer de mama SK-BR-3 que sobreexpresan proteína HER2 con 4D5, uno de varios anticuerpos monoclonales anti-HER2 murinos, inhibió efectivamente la proliferación de células tumorales, en comparación con el tratamiento con un anticuerpo monoclonal de control. La administración de 4D5 a ratones que portaban cánceres de mama y de ovario humanos (xenoinjertos) que sobreexpresaban HER2 prolongó su tiempo de supervivencia libre de tumor. Estudios similares demostraron que la inhibición del crecimiento mediante anticuerpos monoclonales anti-HER2 en xenoinjertos de cáncer gástrico humano en ratones (Pietras RJ et al. (1994) Oncogene 9: 1829-1838) .

Entre las estrategias para inhibir la proteína de HER2 presente de forma abundante sobre la superficie de células tumorales con un anticuerpo, una terapia ha alcanzado disponibilidad comercial en los últimos años. De este modo, la variante humanizada de anticuerpo monoclonal 4D5, o trastuzumab, se comercializa para este propósito en F Hoffman-La Roche y Genentech bajo el nombre comercial de Herceptin®.

De este modo, la sobreexpresión de HER2 ha sido descrita para el cáncer de mama. También se ha conectado con cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, cáncer de glándula salival, cáncer de pulmón (Holbro et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2004. 44: 195-217) y cáncer de esófago (Ekman et al., Oncologist 2007; 12; 11651177, en particular véanse las páginas 1170-1171) .

A pesar de las ventajas obvias mostradas por la terapia con anticuerpos frente a cánceres que se caracterizan por la sobreexpresión de la proteína HER2, se da la circunstancia de que sigue habiendo una variedad de factores que tienen el potencial de reducir la eficacia de los anticuerpos (véase, p. ej., Reilly RM et al. (1995) Clin Pharmacokinet

28: 126-142) . Éstos incluyen los siguientes: (1) penetración limitada del anticuerpo en un tumor sólido grande o en regiones vitales tales como el cerebro; (2) extravasación limitada de los anticuerpos en localizaciones diana debido a una permeabilidad vascular reducida; (3) reactividad cruzada y unión no específica del anticuerpo con tejidos normales, lo que reduce el efecto diana; (4) captación tumoral heterogénea que da como resultado zonas no tratadas; y (6) formación rápida de HAMA y anticuerpos antihumanos humanos, que desactivan el anticuerpo terapéutico.

Adicionalmente, los efectos tóxicos han sido un obstáculo importante en el desarrollo de anticuerpos terapéuticos para el cáncer (Carter P (2001) Nat Rev Cancer 1: 118-129; Goldenberg DM (2002) J Nucl Med 43: 693-713; Reichert JM (2002) Curr Opin Mol Ther 4: 110-118) . La reactividad cruzada con tejidos sanos puede provocar efectos secundarios sustanciales para anticuerpos no conjugados (desnudos) , efectos secundarios que pueden verse potenciados al conjugarse los anticuerpos con toxinas o radioisótopos. Las complicaciones mediadas por efectos inmunes incluyen la dispnoea resultante de efectos tóxicos pulmonares, complicaciones ocasionales del sistema nervioso central y periférico, y una función hepática y renal reducida. Ocasionalmente, se pueden observar complicaciones tóxicas no esperadas, tales como efectos cardiotóxicos asociados al anticuerpo dirigido a HER2 trastuzumab (Schneider JW et al. (2002) Semin Oncol 29 (3, supl. 11) : 22-28) . La radioinmunoterapia con anticuerpos conjugados a isótopos también puede provocar una supresión de médula ósea.

Por lo tanto, a pesar del reciente éxito clínico y comercial de los anticuerpos... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de unión a HER2 que comprende la secuencia de aminoácidos EX1RNAYWEIA LLPNLTNQQK RAFIRKLYDD PSQSSELLX2E AKKLNDSQ en la que X1 de la posición 2 es M, I ó L, y X2 de la posición 39 es S ó C (SEQ ID NO: 1) .

2. Un polipéptido de unión a HER2 según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácido YAKEX1RNAYW EIALLPNLTN QQKRAFIRKL YDDPSQSSEL LX2EAKKLNDS Q en la que X1 de la posición 5 es M, I ó L, y X2 de laposición 42 es S ó C (SEQ ID NO: 2) .

3. Un polipéptido de unión a HER2 según la reivindicación 1 ó 2, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre AEAKYAKEX1R NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLX2EAKK LNDSQ (SEQ ID NO: 3) , y

ESEKYAKEX1R NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLX2EAKK LNDSQ (SEQ ID NO: 4) ; en la que X1 de laposición 9 es M, I ó L, y X2 de la posición 46 es S ó C.

4. Un polipéptido de unión a HER2 según la reivindicación 3, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre

AEAKYAKEMR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLSEAKK LNDSQAPKVD C (SEQ ID NO: 5) , y ESEKYAKEMR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLSEAKK LNDSQAPK (SEQ ID NO: 6) .

5. Un polipéptido de unión a HER2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que además comprende un mercaptoacetilo acoplado a su extremo N-terminal, donde un entorno quelante constituido por una estructura quelante N3S es proporcionado por los átomos de nitrógeno de los tres primeros enlaces peptídicos consecutivos desde el extremo N, junto con el grupo SH del mercaptoacetilo.

6. Un polipéptido de unión a HER2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que comprende un residuo de cisteína ya presente en la secuencia o en forma de un residuo de aminoácido adicional o reemplazando un residuo de aminoácido expuesto superficialmente que no esté implicado en la unión a HER2.

7. Un polipéptido de unión a HER2 según la reivindicación 6, en el que el residuo de cisteína es uno situado en el extremo C-terminal de la SEQ ID NO: 5 o la cisteína adicional se sitúa en el extremo C de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4 ó 6-7, donde el residuo de cisteína opcionalmente va seguido de uno o más residuo (s) de aminoácidos adicional (es) , y donde un entorno quelante constituido por una estructura quelante N3S es proporcionado por los átomos de nitrógeno de tres enlaces peptídicos consecutivos de la tira de residuos de aminoácido constituida por la cisteína y los dos residuos de aminoácido precedentes, junto con el grupo SH del residuo de cisteína.

8. Un polipéptido de unión a HER2 según la reivindicación 6, que comprende un entorno quelante proporcionado por un quelante de poliaminopolicarboxilato acoplado al polipéptido a través de un grupo tiol.

9. Un polipéptido de unión a HER2 según la reivindicación 8, donde el quelante de poliaminopolicarboxilato se selecciona entre ácido 1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecano-1, 4, 7, 10-tetraacético o sus derivados, y ácido dietilentriaminpentaacético o sus derivados.

10. Un polipéptido de unión a HER2 según la reivindicación 9, donde la secuencia de aminoácidos es como se establece en la SEQ ID NO: 5.

11. Un polipéptido radiomarcado que consiste en un radioquelato de un polipéptido de unión a HER2 y un radionucleido, siendo seleccionado dicho radioquelato del grupo que consiste

un polipéptido de unión a HER2 según una cualquiera de las reivindicaciones 5 y 7 con un radionucleido adecuado para la obtención de imágenes médicas, que es 99mTc, o con un radionucleido adecuado para terapia, siendo seleccionado del grupo que consiste en 186Re y 188Re;

un polipéptido de unión a HER2 según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10 con un radionucleido adecuado para la obtención de imágenes médicas, siendo seleccionado del grupo que consiste en 61Cu, 64Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 110mIn, 111In, 44Sc y 86Y, o con un radionucleido adecuado para terapia, siendo seleccionado del grupo que consiste en 225Ac, 212Bi, 213Bi, 67Cu, 166Ho, 177Lu, 212Pb, 149Pm, 153Sm, 227Th y 90Y, donde el radionucleido forma un complejo con el polipéptido de unión a HER2 mediante un entorno quelante, y

un polipéptido de unión a HER2 según la reivindicación 6 ligado mediante una molécula ligando a un radionucleido adecuado para la obtención de imágenes médicas y/o para terapia, seleccionado del grupo que consiste en 211At, 76Br, 18F e isótopos de yodo.

12. Un polipéptido radiomarcado según la reivindicación 11, que comprende la secuencia de aminoácidos fijada en 5 la SEQ ID NO: 5 ligada a través de una molécula ligando a 18F.

13. Un polipéptido radiomarcado según una cualquiera de las reivindicaciones 11-12, donde el radionucleido es adecuado para la obtención de imágenes, para uso en diagnosis.

14. Un polipéptido radiomarcado para uso según la reivindicación 13, donde dicha diagnosis comprende las etapas de:

- administrar un polipéptido radiomarcado según una cualquiera de las reivindicaciones 11-12, donde el radionucleido es adecuado para obtener imágenes, en el interior del cuerpo del sujeto mamífero; y

- obtener una o más imágenes, dentro de las 1-72 horas de administración del polipéptido radiomarcado, de al menos una parte del cuerpo del sujeto usando un instrumento de obtención de imágenes médicas, indicando dicha (s) imágen (es) la presencia del radionucleido en el interior del cuerpo.

15. Un polipéptido radiomarcado según la reivindicación 11, donde el radionucleido es adecuado para terapia, para uso en terapia.

16. Un polipéptido de fusión que comprende al menos un primer resto que consiste en un polipéptido de unión a HER2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y al menos un resto adicional que consiste en un dominio de unión a albúmina de proteína G de estreptococo.

17. Un polipéptido de fusión que comprende al menos un primer resto que consiste en un polipéptido de unión a HER2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y al menos un resto para aplicaciones terapéuticas.

18. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 ó 6.