POLIPÉPTIDO DERIVADO DE PROTEÍNA A Y CAPAZ DE UNIRSE A PDGF.
Polipéptido de unión a receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGF-Rß),
que comprende un motivo de unión a receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas beta, PBM, consistiendo dicho motivo en la secuencia de aminoácidos seleccionada de i) EX2X3X4AAX7EID X11LPNLX16X17X18QW NAFIX25X26LX28X29, en la que, de forma independiente entre sí, X2 se selecciona de L, R y I; X3 se selecciona de R, I, L, V, K, Q, S, H, y A; X4 se selecciona de A, R, N, D, Q, E, H, K, M, S, T, W, F y V; X7 se selecciona de A, R, D, Q, E, G, K y S; X11 se selecciona de A, R, N, D, E, G, K, S, T y Q; X16 se selecciona de N y T; X17 se selecciona de R y K; X18 se selecciona de A, R, N, D, C, Q, E, G, L, K, M, S, T, W y V; X25 se selecciona de K, R, Q, H, S, G y A; X26 se selecciona de S y K; X28 se selecciona de V, R, I, L y A; X29 se selecciona de D y K; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia definida en i), y en la que el polipéptido de unión a PDGF-Rß se une a PDGF-Rß de modo que el valor de KD de la interacción es como máximo 1 x 10 -6 M
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2008/010776.
Solicitante: AFFIBODY AB.
Nacionalidad solicitante: Suecia.
Dirección: BOX 20137 161 02 BROMMA SUECIA.
Inventor/es: GUNNERIUSSON,ELIN, LINDBORG,Malin, LENDEL,Christofer.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 17 de Diciembre de 2008.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K1/04C
- C07K14/31 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Staphylococcus (G).
- C07K14/49 C07K 14/00 […] › Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF).
Clasificación PCT:
- C07K1/04 C07K […] › C07K 1/00 Procedimientos generales de preparación de péptidos. › sobre soportes.
- C07K14/31 C07K 14/00 […] › de Staphylococcus (G).
- C07K14/49 C07K 14/00 […] › Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF).
- C12N15/10 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
- G01N33/68 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
PDF original: ES-2373832_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Polipéptido derivado de proteína A y capaz de unirse a PDGF.
Campo de la invención La presente invención se refiere a polipéptidos que se unen a receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGF-R1) . También se refiere a nuevos procedimientos y usos de tales polipéptidos en el tratamiento y diagnóstico de diferentes afecciones relacionadas con PDGF-R1.
Antecedentes
El receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGF-R1) es una tirosina quinasa que atraviesa la membrana. El ligando de PDGF se compone de combinaciones de las cadenas homólogas A, B, C y D, combinadas con homo o heterodímeros. PDGF-R1 se une a PDGF-BB con alta afinidad y PDGF-AB con baja afinidad. La unión a ligando conduce a dimerización y transfosforilación de tirosinas en el dominio quinasa intracelular de los receptores.
PDGF es un factor importante para regular la proliferación celular, diferenciación celular, crecimiento celular y desarrollo. PDGF-R1 está implicado en angiogénesis y en las etapas tempranas de fibrosis. Este receptor representa unan diana atractiva y potencialmente valiosa, por ejemplo para el tratamiento y formación de imágenes moleculares en por ejemplo enfermedades oncológicas y fibróticas.
Están en desarrollo clínico anticuerpos que bloquean el efecto de PDGF-R1 y la provisión continuada de agentes con una afinidad comparable por este receptor sigue siendo un tema de interés sustancial dentro del campo. También es de gran interés la provisión de usos de tales moléculas en el tratamiento y diagnóstico de enfermedad. Es un objeto de la invención proporcionar nuevos agentes de unión a PDGF-R1, que podrían por ejemplo usarse para diagnóstico, formación de imágenes in vitro o in vivo y aplicaciones terapéuticas.
Sumario de la invención
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido de unión a receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGF-R1) , que comprende un motivo de unión a receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta, PBM, consistiendo dicho motivo en una secuencia de aminoácidos seleccionada de i) EX2X3X4AAX7EID X11LPNLX16X17X18QW NAFIX25X26LX28X29, en la que, de forma independiente entre sí, X2 se selecciona de L, R y I;
X3 se selecciona de R, I, L, V, K, Q, S, H, y A;
X4 se selecciona de A, R, N, D, Q, E, H, K, M, S, T, W, F yV;
X7 se selecciona de A, R, D, Q, E, G, K y S;
X11 se selecciona de A, R, N, D, E, G, K, S, T y Q;
X16 se selecciona de N y T;
X17 se selecciona de R y K;
X18 se selecciona de A, R, N, D, C, Q, E, G, L, K, M, S, T, W yV;
X25 se selecciona de K, R, Q, H, S, G y A;
X26 se selecciona de S y K;
X28 se selecciona de V, R, I, L y A;
X29 se selecciona de D y K; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia definida en i) , y en la que el polipéptido de unión a PDGF-R1 se une a PDGF-R1 tal de modo que el valor KD de la interacción es como máximo 1 x 10-6 M.
La definición anterior de una clase de polipéptidos de unión a PDGF-R1 relacionados con secuencia de acuerdo con la invención se basa en un análisis de varias variantes polipeptídicas aleatorias de un armazón parental, que se seleccionaron por su interacción con PDGF-R1 en experimentos de selección. El motivo de unión a PDGF-R1 identificado, o “PBM”, corresponde a la región de unión a diana del armazón parental, constituyendo dicha región dos hélices alfa dentro de un dominio proteico de conjunto de tres hélices. En el armazón parental, los restos aminoacídicos variados de las dos hélices PBM constituyen una superficie de unión para interacción con la parte Fc constante de anticuerpos. En la presente invención, la variación aleatoria de restos de superficie de unión y la selección posterior de variantes han reemplazado la capacidad de interacción con Fc con una capacidad de interacción con PDGF-R1.
Como entenderá el experto en la materia, la función de cualquier polipéptido, tal como la capacidad de unión de PDGF-R1 de los polipéptidos de acuerdo con la invención, depende de la estructura terciaria del polipéptido. Es por lo tanto posible realizar pequeños cambios en la secuencia de aminoácidos en un polipéptido sin afectar a la función del mismo. Por lo tanto, la invención abarca variantes modificadas del PBM de i) , que son tales que la secuencia resultante es la menos 90 % idéntica a una secuencia que pertenece a la clase definida por i) , tal como al menos 93 % idéntica, tal como al menos 97 % idéntica. Por ejemplo, es posible que un resto aminoacídico que pertenezca a un cierto grupo funcional de restos aminoacídicos (por ejemplo, hidrófobo, hidrófilo, polar, etc.) pudiera intercambiarse con otro resto aminoacídico del mismo grupo funcional. En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X17 es R. En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X11 se selecciona de A, R, N, D, E, G, K, S y T. En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X2 se selecciona de L y R. En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X3 se selecciona de R, I, L, V y S.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X4 se selecciona de A, R, N, D, Q, E, H, K, M, S, T y W.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X25 se selecciona de K, R, Q, H y S.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X28 se selecciona de V, R, I y L.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X29 es D.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X25 es K.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X28 es V.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X3 se selecciona de I y V.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X4 se selecciona de A, R, E y K.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X7 se selecciona de A, R y E.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X11 se selecciona de A, R, N y E.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X18 se selecciona de R, E, K y V.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X2 es L.
Como se describe en detalle en la sección experimental a continuación, la selección de variantes de unión a PDGF-R1 ha conducido a la identificación de secuencias de motivo de unión a PDGF-R1 (PBM) individuales. Estas 25 secuencias constituyen realizaciones individuales de la secuencia de PBM i) en la definición de polipéptidos de unión a PDGF-R1 de acuerdo con este aspecto de la presente invención. Las secuencias de motivos de unión a PDGF-R1 individuales se presentan en la Figura 1 y como SEC ID Nº: 1-179. En algunas realizaciones de este aspecto de la invención, la secuencia de PBM i) se selecciona de una cualquiera de SEC ID Nº: 2-3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 11-12, SEC ID Nº: 18-19, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 47, SEC ID Nº: 60
62, SEC ID Nº: 64, SEC ID Nº: 67-68, SEC ID Nº: 71-72, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 80-81, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 86, SEC ID Nº: 91-92, SEC ID Nº: 94-97, SEC ID Nº: 101-103, SEC ID Nº: 105, SEC ID Nº: 109, SEC ID Nº: 111, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 119, SEC ID Nº: 133, SEC ID Nº: 137, SEC ID Nº: 139-140, SEC ID Nº: 149, SEC ID Nº: 153, SEC ID Nº: 160, SEC ID Nº: 164, SEC ID Nº: 170, SEC ID Nº: 174 y SEC ID Nº: 179.
En una realización, el polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la invención comprende un motivo de unión a 35 receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta, PBM, consistiendo dicho motivo en la secuencia de aminoácidos seleccionada de EX2X3X4AAX7EID X11LPNLX16RX18QW NAFIX25X26LX28D, en la que, independientemente entre sí, X2 se selecciona de L y R;
X3 se selecciona de R, I, L, V, Q y S; X4 se selecciona de A, R, D, E, K y V; X7 se selecciona de A, Q y K; X11 se selecciona de A, R, E y S; X16 se selecciona de N y T;
45 X18 se selecciona de R, G, K, S, T y V; X25 se selecciona de K, R, S y A; X26 se selecciona de S y... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Polipéptido de unión a receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGF-R1) , que comprende un motivo de unión a receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas beta, PBM, consistiendo dicho motivo en la secuencia de aminoácidos seleccionada de
i) EX2X3X4AAX7EID X11LPNLX16X17X18QW NAFIX25X26LX28X29, en la que, de forma independiente entre sí, X2 se selecciona de L, R y I; X3 se selecciona de R, I, L, V, K, Q, S, H, y A; X4 se selecciona de A, R, N, D, Q, E, H, K, M, S, T, W, F y V; X7 se selecciona de A, R, D, Q, E, G, K y S; X11 se selecciona de A, R, N, D, E, G, K, S, T y Q; X16 se selecciona de N y T; X17 se selecciona de R y K; X18 se selecciona de A, R, N, D, C, Q, E, G, L, K, M, S, T, W y V; X25 se selecciona de K, R, Q, H, S, G y A; X26 se selecciona de S y K; X28 se selecciona de V, R, I, L y A; X29 se selecciona de D y K; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia definida en i) , y en la que el polipéptido de unión a PDGF-R1 se une a PDGF-R1 de modo que el valor de KD de la interacción es como máximo 1 x 10-6 M.
2. Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que i) es una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 1-179.
3. Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la reivindicación 2, en el que i) se selecciona de SEC ID Nº: 2-3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 11-12, SEC ID Nº: 18-19, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 47, SEC ID Nº.
6. 62, SEC ID Nº: 64, SEC ID Nº.
6. 68, SEC ID Nº.
7. 72, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº.
8. 81, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 86, SEC ID Nº.
9. 92, SEC ID Nº.
9. 97, SEC ID Nº.
10. 103, SEC ID Nº: 105, SEC ID Nº: 109, SEC ID Nº: 111, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 119, SEC ID Nº: 133, SEC ID Nº: 137, SEC ID Nº.
13. 140, SEC ID Nº: 149, SEC ID Nº: 153, SEC ID Nº: 160, SEC ID Nº: 164, SEC ID Nº: 170, SEC ID Nº: 174 y SEC ID Nº: 179.
4. Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que dicho motivo de unión a PDGF-R1 forma parte de un dominio proteico de conjunto de tres hélices.
5. Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
i) K-[PBM]-DPSQSXaXbLLXcEAKKLNDXdQ; en la que [PBM] es un motivo de unión a PDGF-R1 como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3; Xa se selecciona de A y S; Xb se selecciona de N y E; Xc se selecciona de A y S; Xd se selecciona de A y S; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad con una cualquiera de las secuencias definidas anteriormente.
6. Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la reivindicación 5, en el que i) se selecciona de SEC ID Nº: 180
358.
7. Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la reivindicación 6, en el que i) se selecciona de SEC ID Nº: 181182, SEC ID Nº: 184, SEC ID Nº: 186, SEC ID Nº: 190, SEC ID Nº: 239, SEC ID Nº: 251, SEC ID Nº: 257, SEC ID Nº: 290, SEC ID Nº: 332 y SEC ID Nº: 358.
8. Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia seleccionada de SEC ID Nº.
35. 537.
9. Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia seleccionada de SEC ID Nº.
36. 361, SEC ID Nº: 363, SEC ID Nº: 365, SEC ID Nº: 369, SEC ID Nº: 418, SEC ID Nº: 430, SEC ID Nº: 436, SEC ID Nº: 469, SEC ID Nº: 511 y SEC ID Nº: 537.
10. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.
11. Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso como un medicamento.
12. Combinación de un polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 5 un agente terapéutico.
13. Combinación de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso como un medicamento.
14. Polipéptido de unión a PDGF-R1 o combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 12, para tratamiento de una afección relacionada con PDGF-R1 seleccionada de enfermedad cancerosa, tal como gliomas, sarcomas y leucemias; trastornos vasculares, tales como aterosclerosis, reestenosis, hipertensión pulmonar
y enfermedades retinales; enfermedades fibróticas, tales como fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, esclerodermia, glomeruloesclerosis y fibrosis cardiaca.
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