Una población de variantes polipeptídicas basadas en un armazón común,

comprendiendo cada polipéptido en la población la secuencia de aminoácidos de armazón EXXXAXXEIXXLPNLTXXQX XAFIXKLXDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ, (SEC ID Nº: 1) en la que cada X individualmente corresponde a un resto aminoacídico que varía en la población.

Bibliotecas de polipéptidos con un armazón predeterminado Campo de la invención La presente invención se refiere a nuevas poblaciones de variantes polipeptídicas basadas en un armazón común. Estas poblaciones pueden entre otras usarse para proporcionar nuevas proteínas y polipéptidos de unión.

Antecedentes

Se han descrito diferentes procedimientos para la construcción de nuevas proteínas de unión (Nygren PA y Uhlén M (1997) Curr Opin Struct Biol 7: 463-469) . Una estrategia ha sido combinar la generación de bibliotecas y exploración o selección con respecto a propiedades deseadas.

Se han descrito moléculas Affibody® originales, poblaciones de tales moléculas y armazones de tales moléculas entre otros en el documento WO 95/19374, la enseñanza del cual se incorpora en el presente documento por referencia.

En algunas aplicaciones, se desean proteínas, polipéptido o moléculas Affibody®, poblaciones de tales moléculas y armazones con propiedades mejoradas, tales como estabilidad alcalina, baja antigenicidad, estabilidad estructural, susceptibilidad de síntesis química e hidrofilia.

Estabilidad alcalina La producción de agentes farmacéuticos proteicos y reactivos de biotecnología requiere varias etapas de purificación para enriquecer con respecto a producto específico mientras se retiran contaminantes no deseados. La purificación de afinidad mediada por matrices de afinidad proteínicas tales como anticuerpos monoclonales y proteína A Estafilocócica (SpA) permite la purificación eficaz en una etapa. Sin embargo, para hacer esto rentable es deseable poder regenerar de forma apropiada las matrices de afinidad. Esto habitualmente implica un procedimiento conocido como limpieza en sitio (CIP) , en el que los agentes, con frecuencia soluciones alcalinas, se usan para eluir contaminantes.

También se requiere estabilidad alcalina con indicadores de captura de imágenes moleculares para marcar con el núclido de SPECT más habitual tecnecio-99m, y para permitir que se realicen algunos otros tipos de modificaciones químicas.

Baja antigenicidad Los compuestos farmacéuticos basados en proteínas, tales como anticuerpos monoclonales terapéuticos y moléculas Affibody®, tienen el potencial de inducir respuestas inmunes no deseadas en seres humanos. Los principales factores que contribuyen a la inmunogenicidad son presencia de impurezas, agregados proteicos, epítopos ajenos por ejemplo nuevos idiotopos, diferentes alotipos de Ig o secuencias no propias. Además, las interacciones de inmunoglobulina (Ig) de reacción cruzada aumentarán muy posiblemente la probabilidad de generar una respuesta inmune de memoria mediada por linfocitos T específicos frente al producto farmacéutico proteico. Para minimizar el riesgo de interacción no deseada con el sistema inmune es deseable eliminar los epítopos inmunes existentes por ingeniería proteica del producto farmacéutico.

Las moléculas Affibody® derivan de la proteína A estafilocócica (SpA) , que es un receptor asociado a pared celular en la superficie de la bacteria Gram positiva Staphylococcal aureus. De forma más precisa, SpA está compuesta de cinco dominios altamente homólogos que se unen todos a inmunoglobulinas de muchas especies de mamífero incluyendo seres humanos. Cada dominio de SpA interacciona con Ig humanas de dos maneras diferentes; por unión directa con Fcy incluyendo IgG1, IgG2 e IgG4 (Langone JJ (1982) Adv Immunol 32: 157-252) , o por unión con miembros de la familia de VH3 (Silverman GJ y col (1992) Int Rev Immunol 9: 57-78) . El armazón común de las moléculas Affibody® originales es idéntico al dominio B de SpA con la excepción de la mutación G29A, que se incluyó para aumentar la estabilidad proteica y para eliminar un sitio de escisión de hidroxilamina, y la mutación A1V, introducida en una región espaciadora entre los dominios (Nilsson B y col (1987) , Prot Eng 1: 107-113) . Los restos aminoacídicos en SpA que se han implicado en la interacción con Fcy y VH3 se conocen bien y se han descrito en la bibliografía (Graille M y col (2000) Proc Natl Acad Sci USA. 97: 5399-5404) . Se construyó una biblioteca molecular de diferentes moléculas Affibody® seleccionando aleatoriamente restos superficiales en una cara de la molécula, incluyendo restos que se sabe que están implicados en la interacción con Fcy, eliminando de este modo la afinidad por Fcy.

Estabilidad estructural Uno de los factores clave para el éxito de productos farmacéuticos proteicos y peptídicos es la estabilidad de la proteína. Las proteínas que muestran alta estabilidad estructural soportarán con más probabilidad funcionalmente las modificaciones químicas y proteólisis durante la producción así como dentro del cuerpo humano. Además, la estabilidad influirá en el periodo de caducidad de los productos farmacéuticos peptídicos o proteicos así como la vida activa del producto farmacéutico o proteico dentro del cuerpo humano.

Susceptibilidad de síntesis química Los investigadores han obtenido tradicionalmente proteínas por procedimientos biológicos pero la síntesis química de péptidos y proteínas pequeñas es una estrategia complementaria potente y se usa habitualmente en la biología estructural, ingeniería proteica e investigación biomédica. La síntesis química de proteínas ofrece una manera rápida y eficaz de producir proteínas homogéneas sin contaminantes biológicos tales como impurezas de ADN y proteínas de la célula huésped. Además, se aumenta la flexibilidad puesto que la síntesis química permite la incorporación de aminoácidos no naturales, modificaciones químicas e introducción de sondas bioquímicas y biofísicas. El éxito de la síntesis química de péptidos y proteínas depende de la secuencia de aminoácidos de la molécula en cuestión. Ciertos restos aminoacídicos muestran baja eficacia de acoplamiento, lo que significa que necesitan optimizarse varias etapas durante la síntesis lo que es un procedimiento que consume tiempo sin éxito garantizado. Además, los aminoácidos difíciles de introducir eficazmente durante la síntesis química tendrán mayor impacto negativo en el rendimiento proteico cuanto más larga sea la secuencia proteica.

Aumento de la hidrofilia Para la mayoría de las aplicaciones es deseable que los péptidos y proteínas sean altamente solubles, mostrando una baja tendencia a agregarse. Tales características proteicas son especialmente importantes cuando se trata de productos farmacéuticos proteicos. Existe una fuerte correlación positiva entre la hidrofobicidad de superficie proteica y la baja solubilidad y tendencia aumentada a agregarse.

Descripción de la invención Es un objeto de la presente invención proporcionar una población de variantes polipeptídicas basadas en nuevos armazones.

Estos nuevos armazones tienen varias ventajas en comparación con armazones similares conocidos, denominados armazones originales. Las ventajas también se aplican a polipéptidos obtenidos con el uso de estos nuevos armazones. Estas ventajas se analizarán en más detalle posteriormente, pero se proporcionan algunos ejemplos en el presente documento. Por ejemplo, se ha realizado investigación exhaustiva para desarrollar los nuevos armazones polipeptídicos que muestran alta estabilidad en un ambiente alcalino. Un aspecto de la estabilidad alcalina es estabilidad frente a desamidación de asparaginas. Evitar esta reacción mediante rigidez estructural aumentada o reemplazando este resto también proporciona estabilidad química que contribuye a obtener un producto homogéneo, por ejemplo después de producción en un procedimiento de fermentación o almacenamiento, en el que la desamidación de asparaginas contribuye en gran medida a una mezcla heterogénea que es difícil de separar.

Además, se obtuvo un perfil mejorado con respecto a baja antigenicidad (poca unión a IgG) por eliminación en la nueva secuencia de armazón de la afinidad restante con respecto a inmunoglobulinas, principalmente mediada por VH3.

Además, los nuevos armazones se han modificado por ingeniería genética de modo que muestren alta estabilidad estructural con respecto a una estructura alfa helicoidal fácilmente plegada, alta temperatura de fusión y supresión de sitios que se sabe que se dirigen a proteolisis.

Los armazones de molécula Affibody® original contienen varios aminoácidos que se ha mostrado que reducen la velocidad y éxito de síntesis química. Pata tener un procedimiento de producción de proteína Affibody® eficaz, es decir de alto rendimiento y alta producción,... [Seguir leyendo]

1. Una población de variantes polipeptídicas basadas en un armazón común, comprendiendo cada polipéptido en la población la secuencia de aminoácidos de armazón EXXXAXXEIXXLPNLTXXQX XAFIXKLXDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ, (SEC ID Nº: 1) en la que cada X individualmente corresponde a un resto aminoacídico que varía en la población.

2. Una población de variantes polipeptídicas de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de aminoácidos del armazón es

en la que cada X corresponde individualmente a un resto aminoacídico que varía en la población.

3. Una población de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende al menos 1 x 104 moléculas polipeptídicas únicas.

4. Una población de polinucleótidos, caracterizada porque cada miembro de la misma codifica un miembro de una población de polipéptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Una combinación de una población de polipéptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 con

una población de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 4, en la que cada miembro de dicha población de polipéptidos se asocia física o espacialmente con el polinucleótido que codifica ese miembro mediante medios para acoplamiento de genotipo-fenotipo.

6. Un procedimiento para seleccionar un polipéptido deseado que tenga una afinidad por una diana predeterminada de una población de polipéptidos, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una población de polipéptidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3;

(b) poner la población de polipéptidos en contacto con la diana predeterminada en condiciones que permitan la interacción específica entre la diana y al menos un polipéptido deseado que tenga una afinidad por la diana; y (c) seleccionar, basándose en dicha interacción específica, el al menos un polipéptido deseado de la 25 población restante de polipéptidos.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la etapa (a) comprende las etapas preparatorias de proporcionar una población de polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 4 y expresar dicha población de polinucleótidos para producir dicha población de polipéptidos, en la que cada miembro de dicha población de polipéptidos se asocia física o espacialmente con el polinucleótido que codifica ese miembro mediante medios para acoplamiento de genotipo-fenotipo.

8. Un procedimiento para aislar un polinucleótido que codifica un polipéptido deseado que tenga una afinidad por una diana predeterminada, que comprende las etapas de:

- seleccionar dicho polipéptido deseado y el polinucleótido que lo codifica a partir de una población de

polipéptidos usando el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7; .

35. aislar el polinucleótido separado de este modo que codifica el polipéptido deseado.

9. Un procedimiento para identificar un polipéptido deseado que tenga una afinidad por una diana predeterminada, que comprende las etapas de:

- aislar un polinucleótido que codifica dicho polipéptido deseado usando el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8; y

-secuenciar el polinucleótido para establecer por deducción la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido deseado.

10. Un procedimiento para seleccionar e identificar un polipéptido deseado que tenga una afinidad por una diana predeterminada a partir de una población de polipéptidos, que comprende las etapas de:

(a) sintetizar cada miembro de una población de polipéptidos de acuerdo con una cualquiera de las 45 reivindicaciones 1-3 en un vehículo o perla separado;

(b) seleccionar o enriquecer los vehículos o perlas basándose en la interacción del polipéptido con la diana predeterminada; y

(c) identificar el polipéptido por metodología de caracterización de proteínas.

11. Un procedimiento para la producción de un polipéptido deseado que tenga una afinidad por una diana predeterminada, que comprende las etapas de:

- aislar e identificar un polipéptido deseado usando el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9; o

seleccionar e identificar un polipéptido deseado usando el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 10; y

- producir dicho polipéptido deseado.

12. Un procedimiento para la producción de un polipéptido deseado que tenga una afinidad por una diana predeterminada, que comprende las etapas de:

(a1) aislar un polinucleótido que codifique dicho polipéptido deseado usando el procedimiento de acuerdo 10 con la reivindicación 8; o (a2) retrotraducir un polipéptido identificado usando el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10; y (b) después de (a1) o (a2) , expresar el polinucleótido aislado de este modo para producir dicho polipéptido deseado,

13. Un procedimiento para la producción de un primer polipéptido basado en un armazón, que comprende las etapas de proporcionar un segundo polipéptido que tenga afinidad por una diana predeterminada estando dicho segundo polipéptido basado en un armazón original derivado de SpA, y mutar los aminoácidos del armazón original para generar el primer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del armazón EXXXAXXEIXXLPNLTXXQX XAFIXKLXDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ (SEC ID Nº: 1) , en la que cada X individualmente corresponde a un resto aminoacídico que se conserva del segundo polipéptido.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha secuencia de aminoácidos del armazón es en la que cada X corresponde individualmente a un resto aminoacídico que se conserva del segundo polipéptido.

15. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14, en el que dicho armazón original comprende una secuencia de aminoácidos del armazón seleccionada de EXXXAXXEIXXLPNLNXXQXXAFIXSLXDD PSQSANLLAE AKKLNDAQ (SEC ID Nº: 3) y en la que cada X corresponde individualmente a cualquier resto aminoacídico.

16. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en el que dicho armazón original deriva de SpA dominio B y comprende una mutación G29A, que corresponde a A en la posición 22 en SEC ID Nº: 1 y A en la posición 27 en SEC ID Nº: 2.

17. Un polipéptido que tiene afinidad por una diana predeterminada, que puede obtenerse por un procedimiento de

acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-16 y comprende la primera secuencia de aminoácidos del armazón EXXXAXXEIXXLPNLTXXQX XAFIXKLXDD PSQSSELLSE AKKLNDSQ, (SEC ID Nº: 1) , en la que cada X corresponde a un resto aminoacídico seleccionable de forma aleatoria en un segundo polipéptido basado en una secuencia de aminoácidos del armazón original y en el que dicho segundo polipéptido tiene afinidad por dicha diana predeterminada.

18. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicha primera secuencia de aminoácidos del armazón es en la que cada X corresponde a un resto aminoacídico seleccionable de forma aleatoria en un segundo polipéptido basado en una secuencia de aminoácidos del armazón original y en el que dicho segundo polipéptido tiene afinidad por dicha diana predeterminada.

19. Uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17-18 como un reactivo de 5 detección, reactivo de captura o reactivo de separación.

20. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17-18 para su uso en terapia.

21. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17-18 para su uso como un agente de diagnóstico.

22. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17-18 en el que dicha diana se selecciona 10 de TNF-a, insulina y Taq polimerasa.