Nucleótidos modificados para la secuenciación de polinucleótidos.

Una molécula de nucleótido modificada que comprende una base purina o pirimidina y una porción de azúcarribosa o deoxiribosa con un grupo de bloqueo 3'-OH removible covalentemente unido a ella,

tal que el átomo decarbono 3' tiene unido un grupo de la estructura-O-Zen donde Z es cualquiera de -C(R')2-N(R")2'C(R')2-N(H)R", y -C(R')2-N3,en donde cada R" es, o es parte de un grupo protector removible;

cada R' es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilalquilo, alquenilo,alquinilo, arilo, heteroarilo, heterocíclico, acilo, ciano, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi o amido, o un marcadordetectable unido a través de un grupo de enlace; o (R')2 representa un grupo alquilideno de la fórmula ≥C(R''')2en donde cada R''' puede ser igual o diferente y se selecciona del grupo que comprende átomos de hidrógeno yhalógeno y grupos alquilo; y

en donde dicha molécula puede reaccionar para producir un producto intermedio en el cual cada R" se intercambia porH, dicho producto intermedio se disocia bajo condiciones acuosas para proporcionar una molécula con un 3'OHlibre.

Nucleótidos modificados para la secuenciación de polinucléotidos La invención se relaciona con nucleótidos modificados. Particularmente, esta invención describe nucleótidos que tienen un grupo protector removible, su uso en los métodos de secuenciación de polinucleótidos y un método para la desprotección química del grupo protector.

Los avances en el estudio de moléculas se han dirigido, en parte, por el mejoramiento en las tecnologías usadas para caracterizar las moléculas o sus reacciones biológicas. En particular, el estudio de los ácidos nucleicos ADN y ARN se ha beneficiado de tecnologías en desarrollo usadas para el análisis de secuencia y el estudio de eventos de hibridación.

Un ejemplo de las tecnologías que han mejorado el estudio de los ácidos nucleicos es el desarrollo de matrices fabricadas de ácidos nucleicos inmovilizados. Estas matrices consisten típicamente en una matriz de alta densidad de polinucleótidos inmovilizados sobre un material de soporte sólido. Ver, por ejemplo, Fodor y otros, Trends Biotech. 12:1926, 1994, que describe formas de ensamblar los ácidos nucleicos usando una superficie de vidrio sensibilizada químicamente protegida por una máscara, pero expuesta en áreas definidas para permitir la unión de fosforamiditas de nucleótidos modificados adecuadamente. Las matrices fabricadas también se pueden producir mediante la técnica de "impresión" de polinucleótidos conocidos sobre un soporte sólido en posiciones predeterminadas (por ejemplo, Stimpson y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 92:6379-6383, 1995) .

La secuenciación por síntesis de ADN requiere idealmente la incorporación controlada (es decir, uno a la vez) del nucleótido complementario correcto opuesto al oligonucleótido que está siendo secuenciado. Esto permite la secuenciación precisa mediante la adición de nucleótidos en múltiples ciclos ya que cada residuo de nucleótido se secuencia de uno en uno, evitando así que ocurra una serie no controlada de incorporaciones. El nucleótido incorporado se lee usando un marcador adecuado unido a este antes de la separación de la porción del marcador y la siguiente ronda posterior de la secuenciación. Con el fin de garantizar que se produzca solamente una única incorporación, se requiere una modificación estructural ("grupo de bloqueo") de los nucleótidos de secuenciación para asegurar una incorporación de un único nucleótido, pero esto impide después cualquier incorporación de nucleótidos adicional en la cadena de polinucleótidos. El grupo de bloqueo debe entonces ser eliminado, bajo condiciones de reacción que no interfieren con la integridad del ADN que se secuencia. El ciclo de secuenciación puede continuar después con la incorporación del siguiente nucleótido marcado, bloqueado. Con el fin de ser de uso práctico, el proceso entero debe consistir en etapas enzimáticas y químicas altamente específicas, y de alto rendimiento para facilitar múltiples ciclos de secuenciación.

Para ser útiles en la secuenciación del ADN, los nucleótidos, y más usualmente los trifosfatos de nucleótidos, generalmente requieren un grupo de bloqueo 3' OH para evitar que la polimerasa usada para incorporarla en una cadena de polinucleótidos continúe replicándose una vez que se añade la base en el nucleótido. Existen muchas limitaciones sobre la idoneidad de una molécula como un grupo de bloqueo. Esta debe ser tal como para impedir que las moléculas de nucleótido adicionales se añadan a la cadena de polinucleótidos mientras que al mismo tiempo sean fácilmente extraíbles de la porción de azúcar sin causar daño a la cadena de polinucleótidos. Además, el nucleótido modificado debe ser tolerado por la polimerasa u otra enzima adecuada que se usa para incorporar en la cadena de polinucleótidos. El grupo de bloqueo ideal por lo tanto exhibirá una estabilidad a largo plazo, eficientemente incorporado por la enzima polimerasa, causará un bloqueo total de incorporación secundaria o adicional y tendrá la capacidad de ser eliminado bajo condiciones suaves que no causen daño a la estructura del polinucleótido, preferentemente en condiciones acuosas. Estos estrictos requerimientos son obstáculos formidables para el diseño y la síntesis de los nucleótidos modificados requeridos.

Los grupos de bloqueo reversibles para este fin se han descrito anteriormente, pero ninguno de ellos generalmente reúne los criterios anteriores para los polinucleótidos, por ejemplo, la química compatible con el ADN.

Metzker y otros, (Nucleic Acids Research, 22 (20) : 4259-4267, 1994) describe la síntesis y uso de ocho 5'-trifosfatos de 2deoxiribonucleósido 3'-modificado (dNTP 3'-modificado) y la prueba en dos ensayos del molde de ADN para la actividad de incorporación. Los dNTP 3' modificados incluyen el 3' alil 5'-trifosfato de deoxiriboadenosina (3'-alil dATP) . Sin embargo, el compuesto 3' alilo bloqueado no se usó para demostrar un ciclo completo de la terminación, la desprotección y la reiniciación de la síntesis de ADN: los únicos resultados de la prueba presentados fueron los que mostraron la capacidad de este compuesto para terminar la síntesis de ADN en un ensayo único de terminación, de esos ocho ensayos realizados, cada uno con una ADN polimerasa diferente.

La solicitud de patente internacional WO02/29003 (The Trustees of Columbia University in the City of New York) describe un método de secuenciación el cual, puede incluir el uso de un grupo protector alilo para tapar el grupo 3'-OH en una cadena creciente de ADN en una reacción de la polimerasa. El grupo alilo se introduce de acuerdo con el procedimiento de Metzker (más abajo) y se dice que se eliminó usando la metodología reportada por Kamal y otros (Tet. Let, 40, 371372, 1999) .

La metodología de desprotección de Kamal emplea yoduro de sodio y clorotrimetilsilano a fin de generar yodotrimetilsilano in situ, en disolvente de acetonitrilo, inactivando el tiosulfato de sodio. Después de la extracción en acetato de etilo y el secado (sulfato de sodio) , a continuación la concentración a presión reducida y la cromatografía en columna (acetato de etilo:hexano; 2:3 como eluyente) , se obtuvieron alcoholes libres al 90-98% de rendimiento.

En WO02/29003, la desprotección del alilo de Kamal se sugiere como directamente aplicable en la secuenciación del ADN sin modificación, siendo las condiciones de Kamal suaves y específicas.

Aunque Metzker informa la preparación de un nucleótido o el nucleósido 3' alilo bloqueado y la solicitud de patente internacional WO02/29003 sugiere el uso de la funcionalidad alilo como una caperuza 3' OH durante la secuenciación, ninguno de estos documentos enseña realmente la desprotección del grupo hidroxilo 3'-alilado en el contexto de un protocolo de secuenciación. Aunque el uso de un grupo alilo como un grupo protector de hidroxilo es bien conocido es fácil de introducir y es estable a través de todo el intervalo de pH y a temperaturas elevadas, no existe hasta la fecha, una modalidad concreta de la escisión exitosa de un grupo 3' alilo en condiciones compatibles del ADN, es decir, las condiciones en las que la integridad del ADN no esté total o parcialmente destruida. En otras palabras, no ha sido posible hasta ahora usar nucleótidos 3' alilo OH bloqueados para llevar a cabo la secuenciación del ADN.

La metodología de Kamal es inadecuada para realizarla en medios acuosos, ya que el cloruro de TMS se hidrolizará previniendo la generación in situ de yoduro de TMS. Los intentos para llevar a cabo la desprotección de Kamal (en acetonitrilo) en la secuenciación no han tenido éxito en nuestras manos.

La presente invención se basa en el sorprendente desarrollo de un número de grupos de bloqueo reversibles y los métodos de desprotección de ellos en condiciones compatibles con el ADN. Algunos de estos grupos de bloqueo son nuevos per se, mientras que otros se han descrito en la técnica anterior, pero, como se señaló anteriormente, no ha sido posible usar estos grupos de bloqueo en la secuenciación del ADN.

Una característica de la invención se deriva del desarrollo de un método completamente nuevo de desprotección de alilo. Nuestro procedimiento es de amplia aplicabilidad para la desprotección de prácticamente toda la funcionalidad del hidroxilo protegido con alilo y se puede efectuar en solución acuosa, en contraste a la metodología de Kamal y otros (que se lleva a cabo en acetonitrilo) y a los otros métodos conocidos generalmente en la técnica anterior que son altamente sensibles al oxígeno y a la humedad. Una característica adicional de la invención se deriva de la elaboración de una nueva clase de grupos protectores. Estos se basan en acetales y grupos protectores relacionados,... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de nucleótido modificada que comprende una base purina o pirimidina y una porción de azúcar ribosa o deoxiribosa con un grupo de bloque.

3. OH removible covalentemente unido a ella, tal que el átomo de carbono 3' tiene unido un grupo de la estructura -O-Z

en donde Z es cualquiera de -C (R') 2-N (R") 2'C (R') 2-N (H) R", y -C (R') 2-N3,

en donde cada R" es, o es parte de un grupo protector removible;

cada R' es independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heterocíclico, acilo, ciano, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi o amido, o un marcador detectable unido a través de un grupo de enlace; o (R') 2 representa un grupo alquilideno de la fórmula =C (R''') 2 en donde cada R''' puede ser igual o diferente y se selecciona del grupo que comprende átomos de hidrógeno y halógeno y grupos alquilo; y

en donde dicha molécula puede reaccionar para producir un producto intermedio en el cual cada R" se intercambia por H, dicho producto intermedio se disocia bajo condiciones acuosas para proporcionar una molécula con un 3'OH libre.

2. Una molécula de acuerdo con la reivindicación 1 en donde R' es un alquilo o alquilo sustituido.

3. Una molécula de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en donde - Z es de la fórmula -C (R') -N3.

4. Una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde Z es un grupo azidometilo.

5. Una molécula de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en donde R" es un grupo bencilo o bencilo sustituido.

6. Una molécula de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en donde dicha base se une a un marcador detectable a través de un enlazador escindible o un enlazador no escindible.

7. Una molécula de acuerdo con la reivindicación 6 en donde dicho enlazador es escindible.

8. Una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde un marcador detectable está unido a la molécula a través del grupo de bloqueo por un enlazador escindible o no escindible.

9. Una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 en donde dicho marcador detectable es un fluoróforo.

10. Una molécula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 en donde dicho enlazador sensible a ácido, fotolábil o contiene un enlace disulfuro.

11. Una molécula de nucleótido modificada como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende uno o más átomos 32P en su porción fosfato.

12. Un método para controlar la incorporación de un nucleótido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y complementario a un segundo nucleótido en un polinucleótido objetivo de cadena sencilla en una reacción de secuenciación o síntesis que comprende incorporar en el polinucleótido creciente complementario dicho nucleótido, la incorporación de dicho nucleótido previene o bloquea la introducción de moléculas de nucleósidos o nucleótidos posteriores en dicho polinucleótido creciente complementario.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la incorporación de dicho primer nucleótido se realiza por una transferasa o polimerasa terminal o una transcriptasa inversa.

14. El método de la reivindicación 13 en donde la polimerasa es un Thermococcus sp

15. El método de la reivindicación 14 en donde el Thermococcus sp es 9°N o un mutante simple o mutante doble del mismo.

16. El método de la reivindicación 15 en donde el mutante doble es -Y409V A485L.

17. Un método para determinar la secuencia de un polinucleótido objetivo de cadena sencilla, que comprende monitorear la incorporación secuencial de los nucleótidos complementarios, en donde al menos una incorporación es de un nucleótido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y en donde la identidad del nucleótido incorporado se determina detectando el marcador enlazado a la base, y el grupo de bloqueo y dicho marcador se eliminan antes de la introducción del siguiente nucleótido complementario.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17 en donde el marcador del nucleótido y el grupo de bloqueo se eliminan en una sola etapa de tratamiento químico.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende:

(a) proporcionar una pluralidad de diferentes nucleótidos en donde dicha pluralidad de diferentes nucleótidos son como los definidos en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y en donde el marcador detectable unido a cada tipo de nucleótido puede ser distinguido tras la detección del marcador detectable usado para otros tipos de nucleótidos;

(b) incorporar el nucleótido en el complemento del polinucleótido objetivo de cadena sencilla;

(c) detectar el marcador del nucleótido de (b) , y de ese modo determinar el tipo de nucleótido incorporado;

(d) eliminar el marcador del nucleótido de (b) y el grupo de bloqueo; y

(e) opcionalmente repetir las etapas (b) - (d) una o más veces; y de ese modo determinar la secuencia de un polinucleótido objetivo de cadena sencilla.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde cada uno de los nucleótidos se ponen en contacto con el objetivo secuencialmente, con la eliminación de los nucleótidos no incorporados antes de la adición del siguiente nucleótido, y en donde la detección y eliminación del marcador y el grupo de bloqueo se lleva a cabo después de la adición de cada nucleótido, o después de la adición de los cuatro nucleótidos.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde cada uno de los nucleótidos se ponen en contacto con el objetivo simultáneamente, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende una primera etapa y una segunda etapa, en donde la primera etapa, una primera composición que comprende dos de los cuatro nucleótidos se pone en contacto con el objetivo y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador, y en donde en la segunda etapa, una segunda composición que comprende los dos nucleótidos no incluidos en la primera composición se pone en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y después de la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo, y en donde las etapas primera y segunda se repiten opcionalmente una o más veces.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende una primera etapa y una segunda etapa, en donde la primera etapa, una primera composición que comprende uno de los cuatro nucleótidosse pone en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo y en donde la segunda etapa, una segunda composición que comprende los tres nucleótidos no incluidos en la primera composición se ponen en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo y en donde la primera y segunda etapas se repiten opcionalmente una o más veces.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende una primera etapa y una segunda etapa, en donde la primera etapa, una primera composición que comprende tres de los cuatro nucleótidos se ponen en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo y en donde la segunda etapa, una composición que comprende el nucleótido no incluido en la primera composición se pone en contacto con el objetivo, y los nucleótidos no incorporados se eliminan antes de la detección y posterior a la eliminación del marcador y el grupo de bloqueo y en donde la primera y segunda etapas se repiten opcionalmente una o más veces.

25. Un kit que comprende:

(a) una pluralidad de diferentes nucleótidos en donde dicha pluralidad de diferentes nucleótidos son como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10; y

(b) materiales de empaque para ello.

26. Un kit de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el marcador detectable en cada nucleótido puede distinguirse tras la detección del marcador detectable usado para cualquiera de los otros tipos de nucleótidos.

27. El kit de la reivindicación 25 ó 26, comprende además una enzima y tampones adecuados para la acción de la 5 enzima.

28. Uso de un nucleótido como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en un método de secuenciación de Sanger o del tipo Sanger.

29. Un oligonucleótido que comprende un nucleótido modificado de las reivindicaciones 1-11.

30. Un nucleótido trifosfato que comprende un nucleótido modificado de las reivindicaciones 1-11.

FIG. 1

FIG. 2

FIG. 3

FIG. 4

FIG. 5

FIG. 6

FIG. 7