Mutantes de alfa-amilasa.

Variante de la α-amilasa progenitora tipo Termamyl, que tiene la secuencia SEC ID N.

º: 2 donde dicha variante constade la SEC ID N.º: 2 con una de las siguientes mutaciones seleccionadas de:

i)H156Y+A181T+A209V;

ii)H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S;

iii)A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+ H156Y+A181T+A209V;

iv)A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+ H156Y+A181T+N190F+A209V;

v)A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+ H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S,

donde un asterisco (*) indica deleción del aminoácido.

Mutantes de alfa-amilasa

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere, entre otras cosas, a variantes nuevas de a-amilasas progenitoras tipo Termamyl, en particular a variantes que presentan alteraciones en una o más propiedades (con respecto a la progenitora) que son ventajosas con respecto a las aplicaciones de las variantes, en particular, en el tratamiento del

almidón industrial (p. ej., licuefacción o sacarificación del almidón) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las a-amilasas (a-1, 4-glucan-4-glucanohidrolasas, EC 3, 2, 1, 1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligo y polisacáridos 1, 4-glucosídicos lineales y ramificados, y existe una muy amplia bibliografía científica y de patentes relativa a esta clase de enzimas muy importantes industrialmente.

Entre las descripciones más recientes en relación a las a-amilasas, el documento WO 96/23874 proporciona datos estructurales de cristales tridimensionales por rayos X para una a-amilasa tipo Termamyl que consiste en 300 20 residuos de aminoácidos N-terminales de a-amilasa de B. amyloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 4 en la presente y los aminoácidos 301-483 del extremo C. -terminal de la aamilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 2 en la presente (estando este último disponible comercialmente con el nombre comercial Termamyl™) , y que está por tanto muy relacionada con las a-amilasas de Bacillus industrialmente importantes (que en este contexto se incluyen dentro del

significado del término “a-amilasas tipo Termamyl”, y que incluye, entre otros, las a-amilasas de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens y B. stearothermophilus) . El documento WO 96/23874 también describe la metodología para diseñar, en base a un análisis de la estructura de una a-amilasa progenitora tipo Termamyl, variantes de la a-amilasa progenitora tipo Termamyl que presentan propiedades alteradas relativas a la progenitora.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Como se ha indicado anteriormente, la presente invención se refieren, entre otras cosas, a nuevas variantes (mutantes) alfa-amilolíticas de una a-amilasa tipo Termamyl, en particular a variantes que presentan propiedades alteradas que son ventajosas con respecto al tratamiento industrial del almidón (licuefacción o sacarificación del almidón y similares) .

Alteraciones en propiedades que se han conseguido en mutantes de la descripción son alteraciones en, por ejemplo, la especifidad de sustrato, unión de sustrato, modelo de segmentación de sustrato, termoestabilidad, pH/perfil de actividad, pH/perfil de estabilidad [tal como estabilidad aumentada en valores de pH bajos (p. ej. pH<6, en particular

pH<5) o altos (p. ej. pH>9) ], estabilidad hacia oxidación, dependencia de Ca2+, actividad específica, y otras propiedades de interés. Por ejemplo, la alteración puede suponer una variante que, en comparación con la a-amilasa progenitora tipo Termamyl, tiene una dependencia reducida de Ca2+ y/o un pH/perfil de actividad alterado.

La descripción se refiere además, entre otras cosas, a variantes construcciones de ADN que codifican variantes 45 de la invención, a métodos para preparar variantes de la invención, y al uso de variantes de la invención, solas o en combinación con otras enzimas alfa-amilolíticas, en varios procesos industriales, por ejemplo, la licuefacción de almidón.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La a-amilasa tipo Termamyl

Es bien conocido que varias a-amilasas producidas por Bacillus spp. son altamente homólogas en el nivel aminoácido. Por ejemplo, la a-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2 (disponible comercialmente como Termamyl™) se ha descubierto que es aproximadamente un 89% 55 homóloga con la a-amilasa de B. amyloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 4 y aproximadamente un 79% homóloga con la a-amilasa de B.stearothermophilus que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 6. Otras a-amilasas homólogas incluyen una a-amilasa derivada de una cepa de Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375, todas ellas aparecen descritas en detalle en el documento WO 95/26397, y la a-amilasa descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research 60 Communications, 151 (1988) , pp. 25-31 . Otras a-amilasas homólogas incluyen una a-amilasa producida por la cepa de B. licheniformis descrita en el documento EP 0252666 (ATCC 27811) , y las a-amilasas identificadas en los documentos WO 91/00353 y WO 94/18314 . Otras a-amilasas de B. licheniformis tipo Termamyl son Optitherm™ y Takatherm™ (disponibles en Solvay) , Maxamyl™ (disponibles en Gist-brocades/Genencor) , Spezym AA™ (disponible en Genencor) , y Keistase™ (disponible en Daiwa) .

Debido a la homología sustancial encontrada entre estas a-amilasas, se considera que pertenecen a la misma clase de a-amilasas, concretamente a la clase de "a-amilasas tipo Termamyl".

Por tanto, en el contexto presente, el término "a-amilasa tipo Termamyl" tiene por objetivo indicar una a-amilasa que, en el nivel de aminoácido, muestra una homología sustancial con el Termamyl™, es decir, la a-amilasa de B. 10 licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2 del presente documento. En otras palabras, una a-amilasa tipo Termamyl es una a-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2, n.º 4 o n.º 6 del presente documento, o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 1 del documento WO 95/26397 (dicha secuencia de aminoácidos se muestra en la Fig. 1 y Fig. 2 del presente documento) o en la SEC ID N.º 2 del documento WO 95/26397 (dicha secuencia de aminoácidos se muestra en la Fig. 2 del presente documento) o 15 en Tsukamoto et al., 1988, (dicha secuencia de aminoácidos se muestra en la Fig. 2 del presente documento) o i) que muestra al menos un 60%, tal como al menos 70%, por ejemplo al menos un 75%, o al menos un 80%, por ejemplo al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% de homología con al menos uno de dichas secuencias de aminoácidos y/o ii) muestra reactividad cruzada inmunológica con un anticuerpo producido contra al menos una de dichas a-amilasas, y/o iii) está codificada por la secuencia de ADN que hibridiza a las secuencias de ADN que codifican 20 las a-amilasas anteriormente especificadas que son evidentes a partir de las SEQ ID Nos. 1, 3 y 5 de la presente solicitud (dichas secuencias de codificación codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID Nos. 2, 4 y 6 del presente documento, respectivamente) , a partir de la SEC ID N.º 4 del documento WO 95/26397 (dicha secuencia de ADN, junto con el codón de parada TAA, se muestran en la Fig. 1 del presente documento y codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1 del presente documento) y a partir de la SEC ID N.º 5 del documento WO 95/26397, respectivamente.

En conexión con la propiedad i) , la "homología" puede ser determinada mediante el uso de cualquier algoritmo convencional, preferiblemente mediante el uso del programa GAP del paquete GCG versión 7.3 (Junio 1993) usando valores por defecto para penalizaciones por hueco [Genetic Computer Group (1991) Manual del programa para el

paquete GCG, versión 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE. UU. 53711 ].

Propiedad ii) de la a-amilasa, es decir, la reactividad cruzada inmunológica, se puede ensayar usando un anticuerpo generado contra, o reactivo con, al menos un epítopo de la a-amilasa tipo Termamyl relevante. El anticuerpo, que puede ser monoclonal o policlonal, puede ser producido por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe por Hudson et al., 1989. La reactividad cruzada inmunológica puede determinarse utilizando ensayos conocidos en la técnica, ejemplos de los cuales son ensayo de inmunodifusión radial o de Western Blot, por ejemplo, como se describe por Hudson et al., 1989. A este respecto, la reactividad cruzada inmunológica entre las a-amilasas que tienen las secuencias de aminoácidos SEC ID Nos. 2, 4 y 6, respectivamente, se ha encontrado.

La sonda de oligonucleótido utilizada en la caracterización de la a-amilasa tipo Termamyl de acuerdo con la propiedad iii) anteriormente mencionada se pueden preparar adecuadamente sobre la base de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos completa o parcial de la a-amilasa en cuestión. Las condiciones adecuadas para evaluar la hibridación incluyen remojo previo... [Seguir leyendo]

1. Variante de la a-amilasa progenitora tipo Termamyl, que tiene la secuencia SEC ID N.º: 2 donde dicha variante consta de la SEC ID N.º: 2 con una de las siguientes mutaciones seleccionadas de:

i) H156Y+A181T+A209V;

ii) H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S;

iii) A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+ H156Y+A181T+A209V;

iv) A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+ H156Y+A181T+N190F+A209V;

v) A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+ H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S, 15 donde un asterisco (*) indica deleción del aminoácido.

2. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una variante de a-amilasa según la reivindicación 1. 20

3. Vector de expresión recombinante que lleva un constructo de ADN según la reivindicación 2.

4. Célula que se transforma con un constructo de ADN según la reivindicación 2 o un vector según la reivindicación 3.

5. Célula según la reivindicación 4, que es un microorganismo.

6. Célula según la reivindicación 4, que es una bacteria o un hongo.

7. Célula según la reivindicación 6, que es una bacteria gram positiva tal como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis,

Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus o Bacillus thuringiensis.

8. Uso de una variante de a-amilasa según la reivindicación 1 para lavar y/o lavar platos.

9. Uso de una variante de a-amilasa según la reivindicación 1 para desencolado textil.

10. Uso de una variante de a-amilasa según la reivindicación 1 para licuefacción de almidón.

11. Aditivo detergente que comprende una variante de a-amilasa según la reivindicación 1, opcionalmente en forma de 40 granulado no pulverulento, líquido estabilizado o enzima protegida.

12. Aditivo detergente según la reivindicación 11 que contiene desde 0, 02 hasta 200 mg de proteína enzimática/g de aditivo.

13. Aditivo detergente según la reivindicación 11 o 12, que adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.

14. Composición detergente que comprende una variante de a-amilasa según la reivindicación 1.

15. Composición detergente según la reivindicación 14 que comprende adicionalmente otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.

16. Composición detergente para el lavado de platos manual o automático que comprende una variante de a-amilasa según la reivindicación 1. 55

17. Composición detergente para el lavado de platos según la reivindicación 16 que comprende adicionalmente otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.

18. Composición para el lavado de ropa a mano o automático que comprende una variante de a-amilasa según la 60 reivindicación 1.

19. Composición detergente para el lavado de ropa según la reivindicación 18, que comprende adicionalmente otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.

20. Método para generar una variante según la reivindicación 1, variante que presenta una mayor estabilidad a pH bajo en relación con la progenitora, comprendiendo el método el someter una secuencia de ADN que codifica la a-amilasa progenitora tipo Termamyl a mutagénesis dirigida al sitio.