Moléculas Fc modificadas.

Composición de materia, que comprende un dominio Fc monomérico o multimérico que tiene al menos unresto funcional adicional que está covalentemente unido a uno o más sitios de conjugación específicamenteseleccionado(s) en el dominio Fc a través de la cadena lateral de un residuo de aminoácido en el/los sitio(s)de conjugación,

en donde el residuo de aminoácido en el sitio de conjugación específicamenteseleccionado es un residuo de cisteína añadido al dominio Fc mediante sustitución en un sitio de Fcseleccionado del grupo que consiste en Leu139, Gln143, Ser145 y Ser196, en relación con la secuencia dereferencia SEQ ID NO: 599, o una combinación de cualquiera de éstos.

Moléculas Fc modificadas

Antecedentes de la invención

1. Campo de la técnica

La presente invención se refiere a las técnicas bioquímicas, particularmente a conjugados con dominios Fc de inmunoglobulina.

2. Discusión de la técnica relacionada

El dominio Fc de inmunoglobulina ha encontrado un uso extendido como proteína portadora para una variedad de moléculas terapéuticas y de diagnóstico. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como “Fab”, que se une al antígeno, y un dominio constante conocido como “Fc”, que se relaciona con funciones efectoras tales como activación del complemento y ataque por células fagocíticas. Un Fc tiene una semivida sérica larga, mientras que un Fab tiene una vida corta. (Capon et al. (1989) , Nature 337: 525-31) . Cuando se construye junto con un péptido o proteína terapéutica, un dominio Fc puede proporcionar una semivida más larga, o puede incorporar funciones tales como unión a receptor de Fc, unión a proteína A, fijación delcomplemento y quizá incluso transferencia placentaria. Ídem.

Se han diseñado por ingeniería genética numerosas fusiones de proteínas y péptidos en los extremos o bien amino o bien carboxilo terminal. Además, se han conjugado químicamente una variedad de enzimas y moléculas indicadoras sintéticas con las cadenas laterales de aminoácidos no terminales así como los restos de hidrato de carbono derivatizados del dominio Fc. Además, se han conjugado varios polímeros, tales como polietilenglicol (PEG) , con el dominio Fc con el propósito de mejorar la semivida in vivo y reducir la inmunogenicidad.

El éxito del fármaco Enbrel® (etanercept) llevó a buen término la promesa de agentes terapéuticos modificados con el dominio constante de un anticuerpo. La tabla 1 resume varios ejemplos el uso de proteínas de fusión de Fc conocidos en la técnica.

Tabla 1. Fusión de Fc con proteínas terapéuticas

Forma de Fc Pareja de fusión Implicaciones terapéuticas Referencia

IgG1 Extremo N-terminal de Enfermedad de Hodgkin; Patente estadounidense n.º

CD30-L linfoma anaplásico; 5.480.981

leucemia de células T

Fcy2a murino IL-10 Antiinflamatorio; rechazo Zheng et al, (1995) , J. Immunol.

de trasplantes 154: 5590-600

IgG1 Receptor de TNF Choque septicémico Fisher et al. (1996) , N. Engl. J.

Med. 334: 1697-1702; Van Zee.

K. et al. (1996) , J. Immunol.

156; 2221-30

IgG, IgA, IgM o IgE Receptor de TNF Inflamación, trastornos Patente estadounidense n.º

(excluyendo el autoinmunitarios 5.808.029, expedida el 15 de

primer dominio) septiembre de 1998

IgG1 Receptor de CD4 SIDA Capon et al (1989) , Nature 337:

525-31

IgG1, IgG3 Extremo N-terminal de Anticancerígeno, antiviral Harvill et al. (1995) ,

IL-2 Immunotech. 1: 95-105

IgG1 Extremo C-terminal de Osteoartritis; densidad Documento WO 97/23614,

OPG ósea publicado el 3 de julio de 1997

IgG1 Extremo N-terminal de Antiobesidad Documento WO 98/28427,

leptina presentado el 11 de diciembre

de 1997

Ig C 1 humana CTLA-4 Trastornos autoinmunitarios Linsley (1991) , J. Exp. Med. 174:561-9

Un desarrollo más reciente es la fusión de péptidos generados al azar con el dominio Fc. Véase la patente estadounidense n.º 6.660.843, expedida el 9 de diciembre de 2003 concedida a Feige et al. Tales moléculas han llegado a conocerse como “pepticuerpos”. Incluyen uno o más péptidos unidos al extremo N-terminal, extremo Cterminal, cadenas laterales de aminoácidos o a más de uno de estos sitios. La tecnología de pepticuerpos permite diseñar los agentes terapéuticos que incorporan péptidos que seleccionan como diana uno o más ligandos o receptores, péptidos que se dirigen a tumores, péptidos que se transportan por la membrana, y similares. La tecnología de pepticuerpos ha demostrado ser útil en el diseño de varias de tales moléculas, incluyendo péptidos lineales y constreñidos por puentes disulfuro, “multímeros peptídicos en tándem” (es decir, más de un péptido en una única cadena de un dominio Fc) . Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 6.660.843; la solicitud de patente estadounidense n.º 2003/0195156 A1, publicada el 16 de octubre de 2003 (correspondiente al documento WO 02/092620, publicado el 21 de noviembre de 2002) ; la solicitud de patente estadounidense n.º 2003/0176352, publicada el 18 de septiembre de 2003 (correspondiente al documento WO 03/031589, publicado el 17 de abril de 2003) ; el documento U.S. con número de serie 09/422.838, presentado el 22 de octubre de 1999 (correspondiente al documento WO 00/24770, publicado el 4 de mayo de 2000) ; la solicitud de patente estadounidense n.º 2003/0229023, publicada el 11 de diciembre de 2003; el documento WO 03/057134, publicado el 17 de julio de 2003; la solicitud de patente estadounidense n.º 2003/0236193, publicada el 25 de diciembre de 2003 (correspondiente al documento PCT/US04/010989, presentado el 8 de abril de 2004) ; el documento U.S. con número de serie 10/666.480, presentado el 18 de septiembre de 2003 (correspondiente al documento WO 04/026329, publicado el 1 de abril de 2004) , la solicitud de patente estadounidense n.º 2006/0140934, publicada el 29 de junio de 2006 (correspondiente al documento WO 2006/036834, publicado el 4 de abril de 2006) . La técnica se beneficiaría de una tecnología adicional que permitiese tal diseño racional de agentes terapéuticos polipeptídicos.

Los enfoques convencionales para la conjugación química con el dominio Fc de inmunoglobulina incluyen acoplamiento al azar con aminas primarias que se producen de manera natural tales como lisina y el extremo amino terminal o ácidos carboxílicos tales como ácido glutámico, ácido aspártico y el extremo carboxilo terminal. Alternativamente, puede lograrse un acoplamiento específico de sitio semiselectivo a través de conjugación Nterminal en condiciones apropiadas, o hidratos de carbono derivatizados tal como se encuentran en proteínas Fc aisladas de fuentes eucariotas, o mediante reducción parcial y acoplamiento de residuos de cisteína nativos. (Por ejemplo, Kim et al., A pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin Fc region as a carrier, documento WO 2005/047337) . Aunque cada uno de estos enfoques se ha aplicado satisfactoriamente, normalmente se ven afectados por grados variables de heterogeneidad del conjugado, rendimientos relativamente bajos y, algunas veces, también se observan pérdidas significativas en la actividad funcional. La técnica se beneficiaría de un procedimiento para la conjugación selectiva, específica de sitio con el dominio Fc de inmunoglobulina sin pérdida significativa en la actividad funcional.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a composiciones de materia y a un procedimiento para prepararlas. La composición de materia de la invención, que es un compuesto farmacológicamente activo, comprende un dominio Fc monomérico o multimérico que tiene al menos un resto funcional adicional que se une covalentemente (o se conjuga) , o bien directamente o bien a través de un ligador, con uno o más sitios de conjugación específicamente seleccionado (s) en el dominio Fc a través de la cadena lateral de un residuo de aminoácido en el/los sitio (s) de conjugación, en la que el residuo de aminoácido en el sitio de conjugación específicamente seleccionado es un residuo de cisteína añadido al dominio Fc mediante sustitución en un sitio de Fc seleccionado del grupo que consiste en Leu139, Gln143, Ser145 y Ser196, en relación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 599, o una combinación de cualquiera de éstos. Un sitio de conjugación interno de este tipo puede estar ya presente en una secuencia de dominio Fc nativo o puede añadirse mediante inserción (es decir, entre aminoácidos en el dominio Fc nativo) o mediante reemplazamiento (es decir, eliminado residuo (s) de aminoácido y sustituyendo diferente (s) residuo (s) de aminoácido canónico (s) y/o no canónico (s) ) en la secuencia de dominio Fc nativo con el fin de crear o “modificar por ingeniería genética” el sitio de conjugación. En este último caso, el número de residuos de aminoácido añadidos no corresponde necesariamente al número de residuos de aminoácido eliminados de la secuencia de dominio Fc previamente existente.

Este procedimiento de la invención de preparación de un compuesto farmacológicamente activo que comprende un dominio Fc incluye:

a. seleccionar al menos un sitio de conjugación interno de una secuencia de dominio Fc, siendo dicho sitio de conjugación un residuo de cisteína añadido al dominio Fc mediante... [Seguir leyendo]

1. Composición de materia, que comprende un dominio Fc monomérico o multimérico que tiene al menos un resto funcional adicional que está covalentemente unido a uno o más sitios de conjugación específicamente seleccionado (s) en el dominio Fc a través de la cadena lateral de un residuo de aminoácido en el/los sitio (s)

de conjugación, en donde el residuo de aminoácido en el sitio de conjugación específicamente seleccionado es un residuo de cisteína añadido al dominio Fc mediante sustitución en un sitio de Fc seleccionado del grupo que consiste en Leu139, Gln143, Ser145 y Ser196, en relación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 599, o una combinación de cualquiera de éstos.

2. Composición de materia según la reivindicación 1, en donde el resto funcional adicional es un resto 10 farmacológicamente activo.

3. Composición de materia según la reivindicación 2, en donde el resto farmacológicamente activo es un polipéptido, un péptido o un resto peptidomimético.

4. Composición de materia según la reivindicación 3, en donde el péptido es un péptido de toxina y/o comprende un péptido cíclico.

5. Composición de materia según la reivindicación 2, en donde el resto farmacológicamente activo es un resto orgánico no peptídico.

6. Composición de materia según la reivindicación 1, en donde el resto funcional adicional es un resto marcado que comprende un radioisótopo, una enzima, un resto de biotinilo, un fluoróforo o un cromóforo.

7. Composición de materia según la reivindicación 1, en donde el resto funcional adicional se selecciona del

grupo que consiste en un sustrato inmovilizado, un resto que prolonga la semivida, un polímero y polietilenglicol.

8. Composición de materia según la reivindicación 7, en donde el resto que prolonga la semivida es un polietilenglicol, un copolímero de etilenglicol, un polipropilenglicol, un copolímero de propilenglicol, una carboximetilcelulosa, una polivinilpirrolidona, un poli-1, 3-dioxolano, un poli-1, 3, 6-trioxano, un copolímero de etileno/ maleico anhídrido, un poliaminoácido, una dextrano-n-vinilpirrolidona, una poli-n-vinilpirrolidona, un homopolímero de propilenglicol, un polímero de óxido de propileno, un polímero de óxido de etileno, un poliol polioxietilado, un poli (alcohol vinílico) , una cadena glicosilada lineal o ramificada, un poliacetal, un ácido graso de cadena larga, un grupo alifático hidrófobo de cadena larga, un dominio Fc de inmunoglobulina, una albúmina, una transtiretina, una globulina de unión a tiroxina, o un ligando que tiene una afinidad por una proteína sérica de semivida larga, seleccionándose dicho ligando del grupo que consiste en ligandos peptídicos y ligandos de molécula pequeña; o una combinación de cualquiera de estos miembros.

9. Composición de materia según la reivindicación 1 de fórmula

en donde: F1 es un monómero del dominio Fc monomérico o multimérico;

X1 está covalentemente unido al extremo N-terminal de F1 a través del sitio a-amino de F1;

X2 está covalentemente unido al extremo C-terminal de F1 a través del sitio a-carboxilo de F1;

X3 está covalentemente unido a uno o más sitios de conjugación específicamente seleccionado (s) en F1

seleccionado (s) de un residuo de cisteína añadido al dominio Fc mediante sustitución en un sitio de Fc seleccionado del grupo que consiste en Leu139, Gln143, Ser145 y Ser196, en relación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 599, o, si g >1, cualquier combinación de estos miembros;

X1, X2 y X3 se seleccionan cada uno independientemente de - (L1) c-P0, - (L1) c-P1, - (L1) c-P1- (L2) d-P2, - (L1) c-P1 (L2) d-P2- (L3) e-P3 y - (L1) c-P1- (L2) d-P2- (L3) e-P3- (L4) f-P4;

P0, P1, P2, P3 y P4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en: i) un dextrano o polímero farmacéuticamente aceptable; ii) un polipéptido, péptido, peptidomimético o resto orgánico no peptídico farmacológicamente activo;

iii) un radioisótopo, una enzima, un resto de biotinilo, un fluoróforo o un cromóforo; y

iv) un sustrato inmovilizado, siempre que en una cadena que comprenda más de un resto funcional adicional, el sustrato inmovilizado sea el resto más distal de F1, y no puede haber más de un sustrato inmovilizado en la cadena;

L1, L2, L3 y L4 son cada uno independientemente ligadores;

a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1; y

g es 1, 2, 3 ó 4.

10. Composición de materia según la reivindicación 9, en donde el dominio Fc comprende un dominio Fc de IgG.

11. Composición de materia según la reivindicación 1, en donde el dominio Fc comprende un dominio Fc de IgG1.

12. Composición de materia según la reivindicación 11, en donde el dominio Fc de IgG1 comprende SEQ ID NO: 600 o SEQ ID NO: 603.

13. Composición de materia según la reivindicación 9, endonde a = 0 y b = 1, o a = 1 y b = 0, o a = 1 y b = 1, o a = 0 y b = 0.

14. Composición de materia según la reivindicación 9, en donde X3 comprende polietilenglicol (PEG) .

15. Composición de materia según la reivindicación 9, en donde X3 tiene la estructura - (L1) c-P1 o - (L1) c-P1- (L2) d-P2

.

16. Composición de materia según la reivindicación 9, en donde g = 1 ó 2.

17. Composición de materia según la reivindicación 1, que comprende un péptido o polipéptido de unión a angiotensina 2 (ang-2) , o un péptido o polipéptido de unión a miostatina, o un péptido o polipéptido mimético de eritropoyetina (mimético de EPO) , o un péptido o polipéptido mimético de trombopoyetina (mimético de TPO) .

18. Composición de materia según la reivindicación 9, en donde cualquiera de X1, X2 o X3 comprende un péptido o polipéptido de unión a angiotensina 2 (ang-2) , o un péptido o polipéptido de unión a miostatina, o un péptido o polipéptido mimético de eritropoyetina (mimético de EPO) , o un péptido o polipéptido mimético de trombopoyetina (mimético de TPO) .

19. Composición de materia según la reivindicación 18, en donde el péptido o polipéptido de unión a ang-2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOS: 100 a 189 y 612, preferiblemente SEQ ID NO: 147.

20. Composición de materia según la reivindicación 18, en donde F1 comprende un dominio Fc de IgG1.

21. Composición de materia según la reivindicación 18, en donde el péptido o polipéptido de unión a miostatina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOS: 219 a 509, 613 y 616, preferiblemente SEQ ID NO: 365.

22. Composición de materia según la reivindicación 18, en donde el péptido o polipéptido mimético de EPO comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOS: 1 a 27 y 614, preferiblemente SEQ ID NO: 2.

23. Composición de materia según la reivindicación 18, en donde el péptido o polipéptido mimético de TPO comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOS: 28 a 99 y 615, preferiblemente SEQ ID NO: 28.

24. Composición de materia según la reivindicación 1, que comprende un péptido o polipéptido de unión a factor de crecimiento nervioso (NGF) o un péptido o polipéptido de unión a factor de activación de células B (BAFF) .

25. Composición de materia según la reivindicación 9, en donde cualquiera de X1, X2 o X3 comprende un péptido o polipéptido de unión a factor de crecimiento nervioso (NGF) o un péptido o polipéptido de unión a factor de activación de células B (BAFF) .

26. Composición de materia según la reivindicación 25, en donde el péptido o polipéptido de unión a NGF

comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOS: 190 a 218.

27. Composición de materia según la reivindicación 25, en donde el péptido o polipéptido de unión a BAFF comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOS: 510 a 594.

28. Composición farmacéutica, que comprende la composición de materia según la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

29. ADN que codifica para el dominio Fc monomérico o multimérico comprendido por la composición de materia según la reivindicación 1.

30. Vector de expresión que comprende el ADN según la reivindicación 29.

31. Célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 30.

32. Célula huésped según la reivindicación 31, en donde la célula es una célula bacteriana o de mamífero.

33. Procedimiento para preparar un compuesto farmacológicamente activo, que comprende:

a) seleccionar al menos un sitio de conjugación interno de una secuencia de dominio Fc, siendo dicho sitio de conjugación un residuo de cisteína añadido al dominio Fc mediante sustitución en un sitio de Fc seleccionado del grupo que consiste en Leu139, Gln143, Ser145 y Ser196, en relación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 599, o una combinación de cualquiera de éstos, siendo dicho sitio de conjugación propenso a la conjugación de un resto funcional adicional mediante una química de conjugación definida a través de la cadena lateral de un residuo de aminoácido en el sitio de conjugación; y

b) conjugar un resto funcional predeterminado con el sitio de conjugación seleccionado empleando la química de conjugación definida.

34. Procedimiento según la reivindicación 33, en dondeuna construcción génica que codifica para la secuencia de dominio Fc se expresa en una célula bacteriana o de mamífero.

35. Composición de materia según la reivindicación 1, en donde:

(a) la composición de materia es un anticuerpo modificado de modo que comprende al menos un resto funcional adicional X3 unido covalentemente al dominio Fc del anticuerpo a través de uno o más sitios de conjugación específicamente seleccionado (s) en el dominio Fc seleccionado de un residuo de cisteína añadido al dominio Fc mediante sustitución en un sitio de Fc seleccionado del grupo que consiste en Leu139, Gln143, Ser145 y Ser196, en relación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 599, o, si hay más de un X3, cualquier combinación de estos miembros;

(b) X3 se selecciona de - (L1) c-P0, - (L1) c-P1, - (L1) c-P1- (L2) d-P2, - (L1) c-P1- (L2) d-P2- (L3) e-P3 y - (L1) c-P1- (L2) d-P2 (L3) e-P3- (L4) f-P4;

P0, P1, P2, P3 y P4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en: i) un dextrano o polímero farmacéuticamente aceptable; ii) un polipéptido, péptido, peptidomimético o resto orgánico no peptídico farmacológicamente activo; iii) un radioisótopo, una enzima, un resto de biotinilo, un fluoróforo o un cromóforo; y iv) un sustrato inmovilizado, siempre que en una cadena que comprenda más de un resto funcional

adicional, el sustrato inmovilizado sea el resto más distal del dominio Fc, y no puede haber más de un sustrato inmovilizado en la cadena; L1, L2, L3 y L4 son cada uno independientemente ligadores; c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1.

36. Composición de materia según la reivindicación 9, en donde cualquiera de X1, X2 o X3 comprende un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 617.